（一）实验原理

以原代小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryo fibroblasts，MEFs）的分离和培养为例进行说明。常用小鼠品系的母鼠孕期为19～21天，分离完整胚胎进行细胞培养的合适时间为孕期第12.5～14.5天，此时胚胎已相当大，且含有大量未分化的间充质细胞，这是原代小鼠胚胎成纤维细胞的主要来源。

原代小鼠胚胎成纤维细胞有广泛的研究用途，如作为滋养层细胞（feeder cell）支持小鼠胚胎干细胞、人胚胎干细胞的正常培养和传代维持，作为脂肪代谢、天然免疫等领域的重要研究材料，用来诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS cells）进而进行再生和转化医学领域的基础研究工作（图5-1）。

图5-1　小鼠12.5～14.5天胚胎以及分离到的原代胚胎成纤维细胞(https://www.daowen.com)

原代细胞培养（primary culture）是指细胞分离之后至第一次传代之前的细胞培养阶段。原代细胞一旦经过酶消化传代培养过程，就称为细胞系（cell line），细胞系包含具有相同或不同表型的几个细胞谱系。如果用克隆选择或其他方法分离选择得到了其中的一种细胞谱系，且证明分离得到的这种细胞群体具有某些特定的表型特征，这样的细胞系称为细胞株（cell strain）。如果细胞株发生转化（transformation）或永生化（immortalization），则成为连续细胞株（continuous cell strain）。细胞系发生转化或永生化，就成为连续细胞系（continuous cell line）。从连续细胞系通过克隆选择或其他方法分离选择得到了其中的一种细胞谱系，且证明分离得到的这种细胞谱系具有某些特定的表型特征，这样的细胞系称为连续细胞株（图5-2）。

图5-2　原代培养和传代培养过程中的常见术语以及相互关系

原代细胞分离过程一般包括以下3个步骤：①分离获取特定的组织样品；②从组织样品中分离得到细胞；③将细胞接种于培养皿中进行培养。分离得到组织样品后，可通过两种方法分离其中的细胞：①将组织块切碎或剪碎后贴附于培养基质中，细胞可从组织块中向外迁移生长，从而分离到特定细胞群体；②将组织用机械法或酶消化法处理后获得单细胞悬液，再将单细胞悬液接种于适宜的培养基质中，其中的细胞最终会黏附于基质进行生长增殖。分离MEFs细胞一般最常采用的是图5-3中红色箭头标示的过程，即用胰酶在37℃水浴中消化的办法将胚胎躯干消化成单细胞悬液后接种在培养皿中的方法，分离过程可参看图5-3所示。本章介绍内容涉及的常备仪器包括：生物安全柜，CO2细胞培养箱（37℃、5%CO2条件），冰箱，倒置显微镜，37℃水浴锅，离心机，液氮罐，摇床，微量移液器（2～20μl、50～200μl、200～1 000μl量程），细胞计数仪等。