酶联免疫吸附试验
酶联免疫吸附试验是酶联免疫测定技术中应用最广的技术，具有高敏感性、快速、简便、易于标准化等优点，可用于检测多种病原体的抗原和抗体、血液及其他体液中的微量蛋白质成分和细胞因子等。
1.实验原理 ELISA的基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（如聚苯乙烯微量反应板）表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行（图7-1）。ELISA 的基础基于两点：①抗原或抗体的固相化，保持其免疫学活性；②抗原或抗体的酶标记，既保留其免疫学活性，又保留其酶的活性。当加入酶反应的底物后，底物被酶催化为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。
图7-1 酶联免疫吸附实验原理示意图
2.实验类型 ELISA实验可分为双抗体夹心法、双抗原夹心法、间接法、竞争法、捕获法等5种类型，以下主要介绍前3种类型。
（1）双抗体夹心法：用于检测特异抗原（图7-2）。将已知抗体包被在酶联检测板上（固相），加入待检标本，标本中若含有相应抗原即与固相上的抗体结合，洗涤去除未结合成分，加入该抗原特异的酶标记抗体，洗去未结合的酶标记抗体，加底物后显色。一般而言，包被抗体和酶标记的抗体是识别同一抗原上的不同抗原决定基的两种抗体。
图7-2 双抗体夹心法原理示意图
（2）双抗原夹心法：用于检测特异抗体（图7-3）。将已知抗原包被固相，加入待检标本，标本中若含有相应抗体即与固相上的抗原结合，洗涤去除未结合成分，加入该抗体特异的酶标记抗原，洗去未结合的酶标记抗原，加底物后显色。
图7-3 双抗原夹心法原理示意图
（3）间接法：用于检测特异抗体（图7-4）。用已知抗原包被固相，加入待检标本，标本中若含有相应抗体即与固相上的抗原结合，洗涤去除未结合成分，加入酶标记抗抗体，则结合为抗原-抗体-酶标记抗抗体复合物。洗去未结合的酶标记抗抗体，加底物后显色。
图7-4 间接法原理示意图
3.实验步骤（以双抗体夹心法为例）
（1）样本处理及要求(https://www.daowen.com)
1）血清、血浆分离处理要求详见第六章，应避免反复冻融。
2）尿液：用无菌管收集，2 000～3 000转／min，离心20 min。收集上清液，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
3）组织匀浆：用预冷的1×PBS（0.01 M，p H=7.4）冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织移入试管，加入对应体积的PBS（一般按1∶9的重量体积比，如1 g的组织样品对应9 ml的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）。冰浴条件下充分研磨或用组织破碎机进行破碎。为了进一步裂解组织细胞，可对匀浆液进行超声破碎。最后将匀浆液于5 000 g离心5～10 min，取上清液检测。
4）细胞培养物上清液或其他生物标本：1 000 g离心20 min取上清液，或将上清液置于-20℃或-80℃保存，应避免反复冻融。
注意事项：标本采集后尽早进行提取，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行实验，可将标本放于低温保存，应避免反复冻融。标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行ELISA检测。
（2）操作步骤
1）ELISA检测试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡后方可使用。
2）从室温平衡20 min后的铝箔袋中取出所需酶标板板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
3）设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μl。
4）样本孔中加入待测样本50μl，空白孔不加。
5）除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μl，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60 min。
6）弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μl），静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
7）每孔加入底物A、B各50μl，37℃避光孵育15 min。
8）每孔加入终止液50μl，15 min内在试剂盒指定波长处测定各孔的OD值。
9）以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。
（3）酶标仪的使用：酶标仪（microplate reader）即酶联免疫检测仪，是对酶联免疫检测实验结果进行读取和分析的仪器。根据酶标记原理，通过偶联在抗原或抗体上的酶催化显色底物，根据反应呈色物的有无和呈色深浅即OD值的大小进行定性或定量测定，可判断标本中待测抗体或抗原的浓度。