蛋白质组学的研究方法
蛋白质组学根据不同的研究阶段可以分为4个主要步骤：组织或细胞的制备与分离（表21-1）、蛋白质的提取、蛋白质的分离和鉴定、生物信息学分析。
表21-1 样品制备要求与方法
（续表）
1.组织或细胞的制备及分离
（1）原则：细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白质的降解，并提高样品的溶解度，在整个电泳过程中保持蛋白质的溶解状态；防止溶液介质对蛋白质的人为修饰；尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白质，从而保证待研究蛋白质的可检测性；要根据蛋白质的溶解性和蛋白质在细胞中不同的细胞器定位进行分级。如对于定位于细胞核、线粒体或高尔基体等细胞器的蛋白质，可以应用超速离心的方法富集；对于疏水性强的蛋白质可以采用分级提取的方法；对于临床组织样品，如肿瘤组织可以采用激光捕获微解剖（laser capture microdissection，LCM）技术分离癌变上皮类细胞。
（2）方法
1）根据研究目的选择：研究目的是获得尽可能多的蛋白质，还是仅获得所感兴趣的某些蛋白质；是要求全蛋白质表达谱，还是可重复的清晰图片；是需要让蛋白质变性后进行二维电泳还是需要蛋白质保持活性。目的不同，提取液的成分也不同。如更注重保持蛋白质的活性，则需要用PBS或Tris-HCl等缓冲液。
2）根据蛋白质不同特性选择：碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，酸性蛋白质用偏碱性的提取液提取。稀浓度的盐可促进蛋白质的溶解，同时因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点。故可在提取液中加入少量的NaCl等中性盐，一般以0.15 mol／L浓度为宜。对于和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂提取。
3）根据组织蛋白质不同选择：如膜蛋白的提取方法，一般为先用合适的方法分离膜，然后提取膜蛋白，并选择特殊的去污剂选择性分离膜蛋白。
4）低丰度蛋白质的提取：可以将细胞或组织中的全体蛋白质分为几部分，分别进行蛋白质组学研究。
2.蛋白质的提取 蛋白质的提取有标准的方案（图21-1），见第九章。提取的蛋白质一般需要用定量、半定量、凝胶等方法进行质量检验或质量控制（表21-2）。蛋白质浓度测定有Bradford法、BCA法和SDS-PAGE法（考染、银染）。如果蛋白质有明显的降解或抽提过程有核酸的污染，不推荐用于后续的组学研究中。
图21-1 常规样品蛋白质提取流程
表212 常规样品蛋白质组学检测需求量
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3.蛋白质的分离和鉴定 蛋白质的分离、鉴定是蛋白质组学的关键部分，要研究一类细胞或组织中的蛋白质组，首先需要将不同性质（如不同分子量、不同等电点、不同的电荷）的蛋白质分开，然后针对分离开的蛋白质做深入的鉴定研究，以区分不同的细胞或组织中蛋白组成的不同。
（1）双向凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）：即二维凝胶电泳技术，1975年由意大利生化学家O'Farrell和Klose发明。利用蛋白质的带电性和分子量大小的差异通过等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合来分离蛋白质，即先进行第一向的等电聚焦电泳（按照p H 分离蛋白质），然后再进行第二向SDS-PAGE（按照分子量大小分离蛋白质），最后经银染色或考马斯亮蓝染色得到二维分布的蛋白质电泳图（图21-2）。该技术可以分离10～100 kD分子量的蛋白质，具有较高灵敏度和分辨率，可与质谱分析匹配。目前新型的非凝胶技术有液相色谱法（liquid chromatography，LC）和毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）。
（2）色谱法（chromatography）：是利用不同物质在不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果，是一种分离和分析方法。实验过程如图21-3所示。
（3）毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）：是一类以毛细管为分离通道，以高压直流场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法。该技术可分析的成分小至有机离子、大至生物大分子，如蛋白质、核酸等（图21-4）。
图21-2 双向电泳原理示意图
图21-3 色谱法分离蛋白质的实验过程示意图
图21-4 毛细管电泳分离蛋白质装置示意图
（4）质谱法（mass spectrometer，MS）：其基本原理是使样本中各组分在离子源中发生电离，生成不同荷质比（m／z）的带电荷的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器。在质量分析器中，再利用电场和磁场使发生相反的速度色散，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而对物质进行结构鉴定和定量分析。质谱仪组成及工作原理见图21-5。
色谱-质谱联用是现在应用最为广泛的蛋白质组学研究方法，根据色谱流动相的不同又分为气相色谱-质谱联用（GC-MS）和液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）。样品在色谱部分和流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。气质和液质联用体现了色谱和质谱优势的互补，将色谱对复杂样品的高分离能力，与MS具有高选择性、高灵敏度及能够提供分子量与结构信息的优点结合起来，如图21-6所示。
图21-5 质谱仪组成及工作原理示意图
图21-6 气相色谱-质谱联用分离蛋白质原理及过程示意图