流式检测细胞凋亡
1.原理 流式细胞术检测细胞凋亡常用Annexin V／PI双染色法，也可以用其他核酸染料如DAPI、7AAD等代替PI。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧。细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V 是一种分子量为35～36 k D的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V-FITC（或与其他荧光素偶联）可以检测细胞早期凋亡的发生。
PI不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，能够透过细胞膜而使细胞核染红。将Annexin V与PI匹配使用，可将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。PI的激发波长较宽450～600 nm皆可，一般选择较常规的488 nm的激光器激发，发射波长选择580 nm／610 nm／650 nm 附近的通道皆可。PI不适用于转染了RFP的细胞系检测凋亡，转染了GFP或RFP的细胞检测凋亡尽量使用DAPI来代替PI。
Fas单克隆抗体处理某细胞4 h 后，以Annexin V／PI双染色，上机检测凋亡情况（图11-20）。凋亡是个连续的过程，Annexin V-／PI-为活细胞，Annexin V+／PI-为早期凋亡细胞。此时细胞膜结构完整，PI无法进入细胞内部。随着凋亡的进展，细胞膜逐步坍塌破损，PI进入细胞内部并轻微染色，表现为Annexin V+／PI+low，为中早期凋亡。凋亡发生到晚期，细胞核与PI充分染色，表现为Annexin V+／PI+high，为晚期凋亡或死亡细胞。Annexin V-／PI+是由于细胞物理损伤而导致（图11-21）。
图11-20 AnnexinV/PI双染色法检测细胞凋亡示例
图11-21 AnnexinV/PI双染色法检测细胞凋亡实例
2.实验注意点(https://www.daowen.com)
（1）细胞加药时汇合率控制在70%～80%，防止收细胞时对照组细胞太满，导致凋亡增多。
（2）贴壁细胞如果用含有EDTA 的Trypsin消化，消化之后要用PBS洗一遍，再用binding buffer重悬，因为EDTA会螯合Ca2+。
（3）细胞上清液要收集，与消化的细胞合并在一起；细胞处理整个过程要轻柔。
（4）画门时要圈入左下角上方的细胞群。
（5）边界在参照阴性对照基础上，可以根据实际分群情况有变动。
（6）核酸染料PI／7AAD／DAPI／Hochest等做细胞凋亡时的浓度要远低于做细胞周期时的浓度。
（7）染色之后立即上机检测，调定电压值，圈定目的细胞群后，即可低速或中速收细胞，尽量在短时间（1 h）内检测完各组细胞，收完细胞之后再进行补偿调整、分析。