免疫荧光细胞化学技术

免疫荧光细胞化学技术的原理是将已知的抗体或抗原分子标记上荧光素，当与其相对应的抗原或抗体起反应时，在形成的复合物上就带有一定量的荧光素，在荧光显微镜下观察发出荧光的抗原抗体结合部位，检测出抗原或抗体。(https://www.daowen.com)

常用的荧光素有异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）、四甲基异氰酸罗达明（tetramethyl rhodamine isothiocyanate，TMRITC）、四乙基罗达明（lissamine rhodamine B200，RB-200）等，最常用的是FITC 和TMRITC。FITC 为黄色粉末，最大激发波长为490 nm，最大发射波长为520 nm，呈明显的黄绿色荧光。TMRITC为紫红色粉末，易溶于水，最大激发波长为580 nm，最大发射波长为610 nm，为橙红色荧光。

1.直接法 用荧光素标记的特异性抗体直接与相应的抗原结合，以检查出相应的抗原成分。

2.间接法 先用特异性抗体与相应的抗原结合，再用荧光素标记的抗特异性抗体（间接荧光抗体）与特异性抗体相结合，形成抗原-特异性抗体-间接荧光抗体的复合物。

间接法的基本操作步骤：①冰冻切片经固定，PBS充分洗涤。②入一抗，37℃孵育40 min，或4℃过夜，置湿盒中。③PBS洗3 min，重复3次，入荧光素标记的二抗，37℃孵育40 min。④PBS洗3 min，重复3次。⑤甘油缓冲液封片，荧光显微镜观察。

3.双重免疫荧光法 在同一标本上有两种抗原需要同时显示，如A抗原和B抗原。A抗原的抗体用发橙红色荧光的荧光素（如TMRITC）标记，B抗原的抗体用发黄绿色荧光的荧光素（如FITC）标记，将两种荧光抗体按适当比例混合后，加在标本上（一步法），或先将用TMRITC标记的A抗体染色，再将用FITC标记的B抗体染色（两步法），就分别形成抗原抗体复合物，A抗原阳性呈橙红色荧光，B抗原阳性呈黄绿色荧光，这样就明确显示两种抗原的定位。