蛋白质样品的制备

1.破碎细胞提取蛋白质 取新鲜或低温冻存的组织或体外培养的细胞，提取蛋白质。使用匀浆、裂解的方法破碎组织、充分裂解细胞。常用的裂解液称为RIPA Lysis Buffer，是一种传统的细胞组织快速裂解液。在破碎细胞的同时会释放出蛋白酶，蛋白酶需要迅速被抑制以保持蛋白质不被降解。在蛋白质提取过程中，需要加入合适的蛋白酶抑制剂，以避免蛋白质降解，常用的蛋白酶抑制剂有广谱的蛋白酶抑制剂、EDTA（乙二胺四乙酸，金属蛋白酶抑制剂）、PMSF（苯甲基磺酰氟，丝氨酸、半胱氨酸蛋白酶抑制剂）、NaF（氟化钠，磷酸酶抑制剂）等。

图9-2　蛋白质免疫印迹基本操作过程示意图(https://www.daowen.com)

2.蛋白质浓度测定 通常用比色法进行蛋白质浓度的测定，目前最常用考马斯亮蓝法（Bradford法）、二辛可宁酸（BCA）法等，具体原理详见第八章。根据所求样品的实际蛋白质含量，可计算得出样品进行PAGE电泳前、上样总体积中的样品体积，需保证每个样品的上样量（蛋白质含量）一致。

3.蛋白质变性 根据计算结果，将样品进行稀释混匀。在95℃水浴或金属浴5 min以变性蛋白质，使蛋白质从空间结构转变为一级结构（即多聚体解散为单聚体、氧化状态转化为还原状态等）。