（一）概念及原理

1.荧光阈值和CT值 扩增曲线有线性图谱和对数图谱两种形式（图8-5）。基线是扩增曲线的水平部分。荧光阈值（threshold）是在荧光扩增曲线指数扩增阶段（指数期）上人为设定的一个值，一般设置为基线（背景）荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值（cycle threshold value），CT值与荧光阈值有关。荧光定量PCR利用CT值的概念，对扩增的开始阶段（指数期）进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大且扩增效率也恒定，因此该CT值具有极好的重复性。相对来说，扩增终点处检测产物不恒定，差异较大。

2.定量原理 对于一个理想的PCR反应，Xn=X0×2n；对于一个非理想的PCR反应，Xn=X0（1+Ex）n。其中n为扩增反应的循环次数；Xn为第n次循环后的产物量；X0为初始模板量；Ex为扩增效率。

在荧光定量PCR反应中，在扩增产物达到阈值线时，XCT为荧光扩增信号达到阈值线时扩增产物的量，在阈值线设定以后，XCT是一个常数，将其设为N。两边同时取对数，得

XCT=X0（1+Ex）CT=N

lg N=lg X0（1+Ex）CT

整理此式，得(https://www.daowen.com)

lg X0=-lg（1+Ex）×CT+lg N

CT=-1／lg（1+Ex）×lg X0+lg N／lg（1+Ex）

图8-5　实时定量PCR扩增曲线的线性图谱（a）和对数图谱（b）

对于一个特定的PCR反应来说，Ex和N均是常数，故CT与lg X0呈负相关。也即初始模板量的对数值与CT值呈线性关系，初始模板量越多，扩增产物达到阈值时所需的循环数越少。可根据线性方程，由CT值计算出对应的起始模板量。