检测“自噬流”分析自噬性降解过程
上述基于LC3的自噬体数量、LC3表达量的检测是将观察到的自噬体增加、减少或LC3表达水平的高低对应于自噬活性的强弱。而自噬是动态变化的过程，自噬体是整个自噬过程中的一个中间结构。自噬功能障碍可表现在自噬通路的不同阶段，自噬体形成的上游通路受阻（如隔离膜的集结和延伸步骤）时出现自噬体数量减少（生成减少）；自噬体形成的下游通路受阻时，自噬体数量可能增加（降解减少）。自噬体的积聚状态可因为自噬的激活或是自噬体形成后的自噬通路受阻。相应地，自噬体数量的减少可能是因为自噬活性减弱，也可能是自噬性降解增强。要说明细胞自噬活性的强弱，必须观察整个自噬的过程，即通过自噬流（autophagic flux）分析来进一步说明自噬活性。自噬流涵盖自噬体的形成、自噬性底物向溶酶体的运送以及在溶酶体内降解的整个过程。对此过程进行监测，比单纯自噬体检测更能反映自噬活性。
1.长寿命蛋白质降解研究 长寿命蛋白质是自噬降解的主要底物之一，检测长寿命蛋白质在细胞内的变化可反映自噬流的变化。方法如下：细胞在含有同位素标记氨基酸（如14 C-或3 H-标记缬氨酸或亮氨酸）的培养基中生长一段时间（数小时至数天），细胞在此期间合成的蛋白质都将被同位素标记。之后换成不含同位素的培养基，使被标记的短寿命蛋白质通过蛋白酶体途径降解。在诱导自噬后，长寿命蛋白质降解所产生的氨基酸大部分分泌至培养基中，而未降解的长寿命蛋白质则定位于细胞中。因此，分析培养基中的核素含量和细胞沉淀中的核素含量比值变化即可反映细胞中的长寿命蛋白质降解率。通过检测培养上清液中释放的自噬性降解产物的放射性活度即可反映细胞自噬性降解的能力和自噬流的变化特点。
该法存在敏感性高和特异性低的特点，容易将自噬依赖性长寿命蛋白质降解和非自噬依赖性长寿命蛋白质降解相混淆，如同时加入自噬抑制剂作为对比，更能特异性地反映自噬引起的蛋白质降解。如果长寿命蛋白质的降解产物不能及时有效地排除到细胞外，而是持续滞留于细胞中或被细胞循环利用，亦会引起实验结果的偏差，影响结果的准确性和可靠性。
2.p62蛋白结合LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转化实验分析自噬流 p62（sequestosome 1，SQSTM1，死骨片）蛋白是选择性自噬受体，可作为将要被自噬降解的小泡受体，也可作为要被清除的泛素化蛋白聚集物受体。p62蛋白可结合泛素，也可与LC3结合，从而靶向自噬体并促进泛素化蛋白的清除。当自噬流被阻断时，细胞中p62含量增加；当自噬流活化时，p62蛋白含量下降。外源性过表达p62会导致p62蛋白异常聚集，形成蛋白聚集体—p62小体（p62 body）。因此检测内源性p62含量变化较为适宜。自噬流被抑制亦会引起内源性p62蛋白溶解性降低，造成细胞内p62异常聚集和含量增加。p62的降解还与泛素-蛋白酶体系统功能相关，该系统被抑制时会引起p62蛋白的异常聚集和增加。
实际应用时，常用蛋白质免疫印迹技术同时检测细胞中可溶性p62蛋白、不可溶p62蛋白、细胞质分布型的LC3B-Ⅰ蛋白和自噬结构膜结合型的LC3B-Ⅱ蛋白（图16-7）。如果总蛋白质中可溶性p62蛋白减少、不可溶的p62蛋白无明显变化，同时可见LC3B-Ⅰ蛋白向LC3B-Ⅱ蛋白转化量增多，即表明细胞自噬流处于活化状态；如果总蛋白质中可溶性p62蛋白减少、不可溶性的p62蛋白明显增加，那么无论LC3B蛋白含量、亚型和比例如何变化，均表明细胞自噬流被阻断；如果总蛋白质中可溶性p62蛋白降低、不可溶的p62蛋白无显著变化，同时没有发现明显的LC3B-Ⅰ向LC3B-Ⅱ转化，也不能说明自噬流被活化。但p62蛋白的含量改变相对于自噬流的变化存在一定的滞后性。研究发现，当自噬流被活化或抑制时，细胞中LC3B蛋白的含量变化较为迅速，延长一定时间才能发现p62蛋白含量变化。偶尔也可见到p62与LC3B蛋白同步改变。
图16-7 蛋白质免疫印迹检测细胞LC3蛋白与p62蛋白表达
[图片来源：Jing Li，Jian Zhou，Dan Zhang，et al.Bone marrow-derived mesenchymal stem cells enhance autophagy via PI3K／AKT signalling to reduce the severity of ischaemia／reperfusion-induced lung injury[J].J Cell Mol Med，2015，19（10）：2341-2351.](https://www.daowen.com)
此外，免疫荧光或组织化学染色亦可用于p62蛋白分析。免疫染色主要分析细胞质中弥散型和聚集型的p62蛋白分布与含量。同时采用蛋白质免疫印迹和免疫染色分析细胞中p62蛋白变化，并结合LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ蛋白转化分析，则将更为准确和合理。
3.使用自噬工具药物检测LC3蛋白转化 在检测LC3蛋白实验中，设计使用自噬晚期抑制剂，检测LC3B-Ⅰ向LC3-Ⅱ转化是自噬流检测的金指标。如加入溶酶体抑制剂以抑制自噬体的降解，通过比较抑制剂存在与否情况下LC3-Ⅱ蛋白表达的差别可反映自噬性降解情况。加入溶酶体抑制剂后，LC3-Ⅱ蛋白表达明显增强，说明整个自噬和自噬性降解过程正常，增强表达的那部分LC3蛋白反映的是被溶酶体降解的自噬体。在加入处理因素前后的变化即反映自噬活性，如处理因素加入后此差别增加，则代表自噬的增强，反之亦然。
4.mRFP-GFP-LC3双荧光自噬指示体系 自噬诱导后，GFP-LC3融合蛋白锚定于自噬体膜上并与自噬体一起与溶酶体融合。GFP荧光蛋白是酸敏感性蛋白，不易被溶酶体酶降解，但溶酶体内的酸性环境可导致GFP荧光信号的淬灭。红色荧光蛋白mRFP则对酸性环境具有很好的耐受性，是稳定的荧光表达基团。借助于两种荧光蛋白的这种差异，可构建mRFP-GFP-LC3串联体双荧光自噬指示体系（图16-8）。
图16-8 mRFP-GFP-LC3串联体双荧光自噬指示体系
（图片来源：https：／／www.mdpi.com／ijms／ijms-18-00370／article＿deploy／html／images／ijms-18-00370-g003.png）
当自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，由于溶酶体的酸性环境导致GFP淬灭。GFP的减弱可指示自噬溶酶体形成的顺利程度，GFP越少，则从自噬体到自噬溶酶体阶段流通得越顺畅；反之，若融合被抑制，自噬溶酶体进程受阻，而mRFP则稳定表达。在自噬诱导后，可观察到自噬体和自噬溶酶体分别成黄色和红色标记。如果自噬流增加，两种颜色的点状聚集均增加；如果自噬体向自噬溶酶体成熟步骤受阻，黄色点状聚集增加，红色不增加。这种设计实现了自噬体向溶酶体转化步骤的监控，但不能反映降解过程，溶酶体酶的活力和酸化程度也会影响到荧光信号的检测。
自噬流检测是评价细胞自噬是否行使正常功能的重要途径，但检测过程中往往存在技术稳定性差、检测手段单一、缺乏良好对照等情况。任何一种方法都有其局限性，若要客观评价细胞自噬流状态最好联合使用多种方法综合评定。此外，足够的实验重复次数、适当的实验对照也是正确检测自噬流的关键。