质粒和PCR酶切产物的纯化实验

如果质粒酶切时选择的是单一酶切反应，且整个质粒上只有一个这种酶切位点，那么在酶切反应完成后就可以将反应产物直接进行纯化，不需要通过凝胶电泳后再割胶纯化的方式进行；如果质粒是双酶切，且两个酶切位点只有十几到几十个碱基距离，可以将反应产物直接进行纯化，不需要通过凝胶回收的方式。同样，如果通过PCR扩增而来的产物条带很特异，且只有目的条带一条、没有其他杂带，那么这个PCR产物可以直接进行纯化，不需要通过凝胶电泳后再割胶纯化的方式进行；纯化后的PCR产物在经过两个末端的酶切反应后，酶切产物可直接进行纯化，不需要通过凝胶电泳后再割胶回收的方式进行。另外，如果PCR扩增而来的产物条带很特异，只有一条目的条带，也可以直接进行酶切反应，反应后的产物直接用试剂盒纯化即可进行下一步的连接反应。下面以“普通DNA产物纯化试剂盒（DP204）”为例，说明质粒酶切产物、PCR扩增产物、PCR产物酶切反应后的直接纯化操作。

（1）吸附柱平衡：将吸附柱CB2放入收集管中，向吸附柱中加入500μl平衡液BL，12 000 rpm离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2重新放回收集管中。

（2）估计PCR反应液或酶切反应的总体积，向其中加入5倍体积的结合液PB，充分混匀。

（3）将所得溶液加入平衡好的吸附柱CB2中，室温放置2 min，12 000 rpm 离心30～60 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。

（4）向吸附柱CB2中加入600μl漂洗液PW（使用前需加入一定体积的无水乙醇），12 000 rpm离心30～60 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。(https://www.daowen.com)

（5）再次向吸附柱CB2中加入600μl漂洗液PW，12 000 rpm 离心30～60 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。

（6）继续12 000 rpm 离心2 min，尽量除去漂洗液。将吸附柱CB2放入一个干净的1.5 ml离心管中（可用剪刀提前剪去管子的盖子），室温放置2～3 min，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。

（7）向吸附柱CB2的膜中间位置悬空滴加30～50μl纯水，室温放置2 min。12 000 rpm离心2 min，即为纯化后的质粒或PCR产物酶切后的特定DNA片段。

（8）使用紫外分光光度计检测浓度和纯度，然后即可进行质粒和PCR产物的连接反应。