二抗孵育与显色

（1）取出一抗孵育的杂交膜，用洗膜缓冲液洗涤数次（充分洗涤，如4次、每次10 min，或6次、每次5 min）。

（2）按照抗体说明书配制稀释二抗。若用高灵敏度化学发光显色剂如ECL 荧光试剂，可以1∶3 000（甚至更低）稀释HRP标记的二抗。稀释倍数需根据各生产厂家的二抗产品不同、样品蛋白质的表达不同进行调节。

（3）将膜转移至尽可能小的容器中并加入稀释好的二抗，37℃摇床孵育约45 min（或室温摇床孵育约1 h）。(https://www.daowen.com)

（4）用洗膜缓冲液洗涤数次（充分洗涤）。

（5）准备ECL化学发光显色剂，将膜从洗膜缓冲液中取出，用吸水纸稍吸干膜，滴加显色液。

（6）通过用X光片压片或凝胶图像分析系统，检测样品蛋白质表达，扫描及分析。