常见问题分析
1.凝胶不平与漏液
解决办法：①制备凝胶的玻璃板需洗干净；②两块玻璃板底部要对齐；③加入APS和TEMED的量要合适；④加入试剂后充分混合，防止部分胶块聚合不均匀。
2.电泳条带比正常的窄，有“微笑”或“倒微笑”条带；条带微弱
解决办法：①凝胶聚合不均匀，灌胶时尽量混合均匀，动作轻缓；②样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，需进行适当稀释；③底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡；④蛋白质浓度不够，加大上样量；⑤蛋白质样品不能反复冻融，提取过程防止蛋白质降解。
3.凝胶肿胀或卷曲，条带歪斜或漂移，有单个或多个白点
解决办法：①转膜缓冲液过热，注意降温；②凝胶在转膜之前需在转膜缓冲液中浸泡充分；③“三明治”结构不紧凑。确保膜和凝胶之间没有气泡；④缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。用新鲜配制的缓冲液，调整电流／电压。
4.转印膜曝光后背景太深
可能原因：①膜没有均匀浸湿；②膜或缓冲液污染；③封闭不充分；④抗体与封闭剂出现交叉反应；⑤抗体浓度过高；⑥洗涤不充分。(https://www.daowen.com)
解决办法：①PVDF膜转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿，转膜前用缓冲液充分浸泡平衡；②更换新鲜转膜缓冲液；③更换封闭剂或延长封闭时间；④更换合适抗体；⑤做预实验确定一抗、二抗的最佳工作浓度；⑥抗体孵育后进行充分洗涤。
5.杂交信号很弱或没有
可能原因：①抗体不适合于蛋白质免疫印迹；②抗体浓度太低；③抗体保存不当；④抗原不充足；⑤转膜不充分。
解决办法：①设置阳性对照和内参蛋白；②加大抗体浓度；③抗体长期保存应在低温；④增加蛋白质上样量，用已知标准量蛋白质做参照。
6.出现非特异条带
可能原因：①一抗不是唯一特异的；②二抗出现非特异结合。
解决办法：①采用单克隆抗体；②设立不加一抗，只加二抗的平行对照来检测二抗是否有非特异结合。