实验操作步骤

（四）实验操作步骤

1.贴壁培养细胞传代

（1）待MEF细胞生长到完全占满整个10 cm皿底部培养面积时，吸去培养基，加入3～4 ml PBS轻轻洗涤细胞一遍，吸弃PBS。

（2）每个10 cm培养皿中加入1 ml 0.125%胰酶（可根据培养皿的不同进行调整，参见表5-2），室温消化3～5 min。

表5-2　细胞培养常用数据

（3）消化2～3 min后，显微镜下观察消化情况。为了促进细胞消化，可以一手拿培养皿，另一手用手掌轻轻拍打培养皿侧面。

（4）当80%～90%细胞脱离培养皿底壁后，加入约3 ml完全培养基终止消化，使用1 ml移液器吸起培养液，轻轻吹打培养皿底部，使所有细胞脱离底壁，并将消化下来的细胞团块吹打成单细胞悬液。

（5）将所有细胞悬液转移到15 ml离心管中，再吸取1 ml培养基冲洗培养皿底部，将残留的细胞一并转移到离心管中。(https://www.daowen.com)

（6）200 g离心4～5 min，室温进行。

（7）吸掉离心后的细胞上清液，用新鲜培养基2～3 ml重悬细胞，将细胞分散为单细胞悬液。

（8）拿出4～5个新的10 cm 培养皿，每个加入10 ml完全培养基，将重悬后的细胞平均分配到每个皿中，即传代比例为（1∶4）～（1∶5），放入37℃、5%CO2培养箱中，十字交叉摇匀后，静置培养。

（9）一般而言，MEFs细胞只能连续传代扩增5～6代，之后基本上就失去增殖能力了，这时将所有细胞消化收集后以约1 000万的量进行冻存，或进行后续的其他实验。

2.悬浮培养细胞传代 悬浮细胞不存在酶消化的问题，所以只需要将细胞连同培养基一起转移到离心管中，离心弃上清液，重悬后按一定比例接种到新的培养皿中即可，如图5-5所示。

图5-5　贴壁细胞和悬浮细胞的传代过程