目标DNA序列的PCR法克隆
只要PCR扩增中的正向引物和反向引物携带有不同的限制性酶切位点（有时会设计成同一个酶切位点，有时会设计成两个不同的酶切位点），且目的载体的多克隆位点中包含有相同的酶切位点，那么通过酶切反应和连接反应就可将扩增产生的目的片段定向克隆到一个含有匹配末端的载体中，形成一个新的重组质粒。下面以Bam H Ⅰ和Xho Ⅰ作为连接位点，通过PCR法克隆小鼠Zeb1基因到pcDNA3.1（+）质粒为例来说明扩增引物的设计和PCR过程。
（1）设计一对扩增小鼠Zeb1全长编码区序列的引物（参见“第八章 PCR原理及应用”），并在上游引物5′端加入Bam H Ⅰ酶切识别序列和保护碱基序列，在下游引物5′端加入XhoⅠ酶切识别序列和保护碱基序列。具体引物序列如图12-3。
（2）使用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增反应，反应体系如表12-1。
（3）PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，以观察是否扩增出预期大小的产物、是否有其他非特异性条带出现、非特异条带是否与预期大小的产物区分开。如果扩增出预期大小的条带（或即使有其他非特异性的条带扩增出来，但非特异条带大小可以和预期产物大小明显区分开，也就是可以通过割胶回收实验进行回收目的条带），则回到第2步，扩大PCR反应体系（50μl或100μl）重新进行PCR扩增反应。
图12-3 pcDNA3.1质粒图谱及Zeb1基因的扩增引物设计
表12-1 PCR扩增反应体系
（4）同时进行pcDNA3.1（+）质粒的双酶切反应，参见本章“质粒和PCR产物的酶切及琼脂糖凝胶电泳”。(https://www.daowen.com)
（5）将扩大体系后的PCR反应液和质粒酶切反应液进行琼脂糖凝胶电泳，电泳后直接在紫外割胶仪照射下快速割取目的条带和目的载体片段分别放入1.5 ml EP管中进行凝胶回收实验（参见本章“质粒酶切或PCR产物酶切后的纯化和割胶回收”）。回收到的线性化pcDNA3.1（+）质粒暂时保存在冰上或4℃冰箱中。
（6）回收后的PCR目的条带进行双酶切反应，反应体系参见本章“质粒和PCR产物的酶切及琼脂糖凝胶电泳”。
（7）酶切后的PCR目的条带直接进行过柱纯化（参见本章“质粒酶切或PCR产物酶切后的纯化和割胶回收”）。
（8）测定酶切后的线性化质粒和PCR目的条带浓度，按照本章“T4 DNA 连接酶介导的质粒和PCR产物的连接反应”进行连接反应。
（9）连接后进行大肠埃希菌转化LB平板，筛选阳性克隆。
（10）挑取5～6管单克隆菌落，过夜摇菌扩增。
（11）裂解菌液，抽提质粒。
（12）用Bam H Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切反应，选出连接成功的重组质粒。
（13）将重组成功的质粒送到公司进行测序分析，使用质粒的通用引物或自己设计一段引物进行测序。测序结果出来后通过比对分析即可知道所克隆的目的基因序列是不是完全正确，是不是在操作过程中有突变存在。选出完全正确的质粒进行基因转染等下游实验。