（二）工具酶

1.限制性内切酶 全称限制性内切核酸酶（restriction endonucleases），可识别特定的DNA序列并将其切割成两个部分，是重组DNA技术的基础。

根据识别序列和切割序列等的不同，将限制性内切酶分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型。Ⅰ型限制性内切酶的识别序列是不对称的，由两个部分组成，一部分3～4个核苷酸，另一部分4～5个核苷酸，中间由6～8个核苷酸相隔。Ⅰ型酶不在识别序列处进行切割，而是在离识别位点至少1 kb处切割未保护的DNA序列，因此对分子克隆基本没有用处。Ⅲ型酶识别短的不对称DNA 序列，非特异性切割距离识别位点3′端25～28个核苷酸处的DNA序列，因此也对分子克隆用处不大。

对分子克隆来说，最重要的是Ⅱ型限制性内切酶（TypeⅡ）。Ⅱ型酶在各种不同细菌中广泛存在，可能是由于共同的进化需求，也就是针对噬菌体基因组和其他入侵DNA 的强大防御机制。大多数Ⅱ型限制性内切酶可特异性识别长度为4～6个左右长度的回文对称核苷酸序列，并在识别序列中进行切割（如Hha Ⅰ、Hind Ⅲ、Not Ⅰ）。其中，有些Ⅱ型酶可识别连续的DNA序列（如EcoR Ⅰ：5′-G↓AATTC-3′），有些Ⅱ型酶的识别序列则被一些其他序列隔开形成不连续的识别序列（如BglⅠ：5′-GCCNNNN↓NGGC-3′，N代表任A、T、C、G任意一种核苷酸）。切割后产生的DNA末端有两种类型，一些Ⅱ型酶恰好在识别序列的对称轴处切割，产生的DNA片段是平末端序列（如Sma Ⅰ：5′-CCC↓GGG-3′）；而另一些酶的切割位点在对称轴的一侧，从而产生带有突出单链末端的DNA 片段，称为黏性末端（如EcoRⅠ：5′-G↓AATTC-3′）。上述这些Ⅱ型酶的大小都在200～350个氨基酸残基。(https://www.daowen.com)

2.连接酶 DNA连接酶的作用是将内切酶“剪开”的不同DNA片段再次连接起来，组成一个新的重组DNA序列。也即通过催化DNA的5′-磷酸末端与3′-羟基末端之间形成磷酸二酯键而将断裂的DNA完全修复。

实验中常用的T4 DNA连接酶主要是大肠埃希菌来源，是将T4噬菌体的相应编码基因gp30克隆进大肠埃希菌中，从而使其表达T4 DNA连接酶。T4 DNA连接酶包含487个氨基酸残基，可催化DNA、RNA、DNA和RNA之间发生黏性末端或平末端连接反应。

3.DNA聚合酶与PCR技术 即使在整个高度复杂性的基因组中只出现一次目标序列，使用PCR技术也可将其通过指数级别的方式快速特异性的扩增出来，产生数百万的目的序列。DNA聚合酶是PCR技术中最重要的酶之一，目前最常用的DNA 聚合酶是Taq酶。关于PCR的原理和引物设计等内容参见“第八章 PCR原理及应用”。