检测分析系统
检测分析系统是以通道为单位将细胞的各个通道光信号汇总分析，最后得出样品群体中细胞的特征数据。检测分析系统又称电子系统，有三个功能：①将光信号转换成电子信号；②分析所输出的电子信号，以脉冲高度（H）、宽度（W）和积分面积（A）显示；③量化信号，并将其传至计算机。
1.光电倍增管（photomultiplier tuber，PMT） 是将光信号转换成电信号的关键元件。通过带通滤光片将特定波长范围的光导入各自的通道，其实就是进入各自的光电倍增管，一个通道有一个光电倍增管。光电倍增管可将光信号转变成电子信号，并按照一定比例放大。对这个光电转变的调节，主要是通过调节电压。调节电压在合适范围内，使光信号和电信号呈线性比例的关系，具有可对照性；也使不同样本信号强弱可分，强弱兼顾，都能检测到。
细胞流过激光束产生的光信号被转换成电子脉冲信号，如图11-3a所示，经流体动力学聚焦的细胞流过激光束，产生电子脉冲信号。电子脉冲的高度（H）代表最大荧光强度，宽度（W）代表细胞通过激光检测区域的时间，面积（A）代表荧光总量，如图11-3b所示。这三个参数任何一个都可以间接反映该电子脉冲的大小，但面积（A）更能准确反映电子信号大小，最为常用。宽度（W）或高度（H）常被用来辅助去除粘连体细胞（如在细胞周期分析中）。
图11-3 光信号转换成电子脉冲信号对应过程示意图（a）和电子脉冲的三个参数（b）
电子脉冲信号被计算机系统接收和分析，计算机分析系统通过特定软件实时反映收集到的信息，控制流式细胞仪的工作，并分析采集到的信息。
2.流式图 目前流式细胞仪都是高速分析分选的，可达每秒上万细胞的分析速度，分析得到的信息除了FSC和SSC之外，往往还有或多或少几个荧光通道的信息。如此大量的信息，需要流式图既全面又直观地显示出来。流式图有多种，最经典的有一维的直方图和二维的散点图、等高线图和密度图等。流式直方图只能显示一个通道的信息，流式散点图、等高线图和密度图可以同时显示两个通道的信息。最新的软件也能输出热图（heat-map）、t-SNE等降维分析流式图。
（1）一维的直方图：直方图（histogram）也称峰图，横坐标表示荧光信号或散射光信号的强度，纵坐标表示细胞的数目。每个细胞经过检测区域后，接收通道中都能采集到相应强度的信号，信号越强的细胞位于直方图中靠右的位置，而信号弱的细胞靠左，记录一定数目的细胞信号后，每个参数都能得到一个峰状的直方图。利用设门工具圈出某个峰，就能统计出该区域内细胞的百分比。
图11-4 a图为CD3-PerCP信号表达的一维直方图，荧光强度强（右边）的峰代表表达CD3抗原的细胞群（CD3+），左边的峰一般被认为是不表达CD3抗原细胞群的自发荧光。b图为两个样本直方图的叠加图，虚线峰是空白对照，红色实线峰为实验样本，相对于空白对照组，实验样本几乎为全阳性，代表所有的细胞均表达CD11c抗原。
图11-4 流式直方图
（2）二维的散点图：单参数直方图只能显示一个通道的信息，而二维的散点图（dot plot）可同时显示两个通道的信息，比较直观，在实际工作中更常用。横坐标和纵坐标各代表一个参数的信息，这样能得到双阴性、双阳性、横坐标单阳性和纵坐标单阳性群体的表达情况。
图11-5中横坐标代表CD4抗原的表达量，纵坐标代表CD8抗原的表达量，十字门把二维散点图分成四个象限，左上的Q1象限（有的流式软件显示为upper left，UL）为纵坐标单阳性（CD4-CD8+），右上（upper right，UR）的Q2象限为双阳性信号（CD4+CD8+），右下（low right，LR）的Q3象限为横坐标单阳性（CD4+CD8-），左下（low left，LL）的Q4象限为双阴性细胞群体（CD4-CD8-）。
图11-5 流式散点图
散点图中的每个点代表一个细胞，当细胞数特别多时，很难看出群体的密度和精细分布情况，因此数据分析中经常使用二维的伪彩图、密度图、等高线图、斑马图等图谱（图11-6），能更好地区分不同的群体，方便数据分析中的圈门操作。
图11-6 几种二维流式图
[图中依次为二维的散点图（a）、伪彩图（b）、斑马图（c）、等高线图（d）和密度图（e）](https://www.daowen.com)
图11-7 t-SNE流式图
（3）t-SNE流式图：分布随机邻域嵌入（t-distributed stochastic neighbor embedding，t-SNE）的流式数据分析工具，是一种能够对多参数高维度的流式数据进行降维处理的算法，是流式数据可视化工具。t-SNE图是通过机器建模的方法把高维空间点的信息映射到二维图，图的横纵坐标（一般为t-SNE1和t-SNE2）本身没有意义，图中的每个小岛（island）为软件经过算法运算后呈现出的群体，小岛的大小代表该群体细胞的百分比，结合热图（heat-map）功能，能清晰地看到每个参数在各个小岛中的表达量（图11-7）。
通过算法把多维的数据映射在一张二维的t-SNE 图中，图中的小岛代表不同的群体，可以进一步圈出来进行分析。图中通过热图的功能，能看出目标分子CD3在不同小岛中的表达量，颜色越深代表抗原表达越强。
3.流式数据分析 流式细胞仪上样操作时，会通过对照管调节好各通道电压值、荧光补偿等参数，然后记录数据，得到后缀为.fcs的标准格式的原始结果。原始结果可以在流式仪器自带的软件上进行分析，也可利用第三方软件如FlowJo和FCS Express等进行后续分析。
流式数据的分析流程其实就是一个不断设门（gate）和选门的过程，在一幅流式图中，可以通过各种设门工具（矩形、圆形、多边形、十字门、线性门等）圈出目标细胞群，然后对圈出的细胞群体做进一步的分析，最终得到目标细胞群的比例或目标抗原的表达量等信息。
图11-8第一幅FSC／SSC等高线图，通过矩形门圈出目标细胞群，左边的碎片群体被排除在外；第二幅伪彩图中的所有细胞都来源于上一级的细胞门，通过多边形门圈出单个细胞群体、排除粘连细胞；第三幅图圈出死活（Live／Dead）细胞染料阴性的活细胞，且CD45（白细胞共同抗原）阳性的白细胞群体；第四幅图进一步圈出纵坐标阳性的CD3+群体和阴性的CD3-群体做进一步分析。
图11-8 流式设门分析
（1）百分比（%gated）和平均荧光强度（mean fluorescence intensity，MFI）：是两种最常见的结果呈现方式。通过设门的方法圈出某群细胞后，分析软件能统计出该群体的相对百分比，该百分比既可以是该群细胞占当前门内的百分比，也可以是它占所有细胞的百分比（%total）。
MFI是另外一种反应荧光／散射光信号强度的统计参数，流式软件一般能得到几何平均荧光强度（geometric mean）、算术平均荧光强度（mean）和中位数（median）三种平均荧光强度结果。对于一个完全正态分布的抗原表达峰图，这三个参数值是相同的，而其他类型的抗原表达分布图中这三个参数值可能有微弱的差异，但都能反映信号表达的趋势。
（2）线性、对数和双指数显示方式：利用流式软件分析数据时，流式图中的坐标一般可以选择线性（linear）、对数（logarithmic）和双指数（biexponential）三种主要显示方式（不同软件略有差异，此处以FlowJo软件为例）。散射光信号代表的细胞大小和颗粒度等信息，一般会选择线性显示方式（1，100，200，…）；细胞周期实验时为了体现二倍体和四倍体的线性关系，一般也选择线性显示。对于荧光信号，自发荧光和特异性荧光经常会相差几千甚至几万倍，故一般选择对数的呈现方式（101，102，103，…）。双指数是经过算法处理后的一种特殊的显示方式，高荧光强度处（如104，105）仍然以对数方式显示，而弱荧光强度处以类似线性方式显示，如10-3～103这段信号压缩在一格内显示，这样能解决对数方式弱荧光强度分布弥散的缺陷。FlowJo软件中Linear、Logarithmic和Biexponential可以切换，以得到最佳细胞群体分布的显示方式。
FlowJo软件可以更改坐标轴的范围，目的是为了隐藏一些没有细胞群体分布的区域，让细胞群体分布在流式图的中间位置。无论是切换Linear、Logarithmic和Biexponential的显示方式，还是更改坐标轴的量程范围，都是流式图呈现的不同方式，不会影响已有设门的百分比和信号强度MFI值。
图11-9第一幅图为正常对数显示的CD4／CD8双参数流式图；第二幅图为更改了坐标轴范围，横纵坐标均从102开始显示；第三幅横纵坐标均改成Biexponential显示方式，差不多103以内信号被压缩在一格显示。后两幅图经处理后，没有改变目标群体的百分比，但是群体均匀分布在图形中间，是更好的数据显示方式。
图11-9 通过切换流式图坐标找到更好的显示方式
（3）死细胞和粘连细胞的去除：死细胞有非特异性的自发荧光，会影响检测的灵敏度，甚至出现假阳性的结果。为了去除死细胞的干扰，可在上机前加入核酸染料如碘化丙啶（propidium iodide，PI）、7-氨基放线霉素D（7-AAD）等，通过设门的方法提前排除死细胞。死细胞膜是通透的，PI等核酸染料能穿过细胞膜和核酸结合，PI阳性即为死细胞群。如果实验中涉及分析胞内抗原，染色过程中需要有固定破膜的步骤，经此处理后的细胞都变成死细胞，而核酸染料染色法就不适用。这种情况可选择一些可固定破膜的死细胞染料（fixable live dye），其作用的原理是染料与细胞膜上的蛋白氨基结合，在固定破膜步骤前加入这些染料，死细胞膜的胞外和胞内侧均能被染色，活细胞仅胞外侧有染色。所以，强阳性的为死细胞群，弱阳性的为活细胞。
如果流式标本中粘连细胞较多时，数据分析时也需要通过设门排除，圈出单个的细胞进行分析。一般利用散射光的面积（area，A）、高度（heigh，H）和宽度（width，W）参数的组合（图11-3），W 代表的是细胞通过激光检测区域的宽度，如果是二聚体，形成的是两个电脉冲，因此圈出W信号较小的群体即为单细胞；对于单个细胞，其面积A和高度H 呈线性比例。所以，习惯上也用FSC-A／FSC-H 流式图，圈出对角线附近位置的群体为单个细胞，偏离这一斜率的为粘连的细胞群。