实时定量PCR实验方法
1.材料
（1）仪器：常用的有Applied Biosystem TM（ABI）实时PCR 系统（7000、7300、7500、7900等）、BioRad实时PCR检测系统（CFX96等）、Roche Lightcycler实时PCR检测系统、Stratagene定量PCR反应仪、MJ Opticon、Smatcycler和Rotor gene2000。仪器各有特点，根据需要选用。下述实验使用仪器为ABI 7500，另需冷冻离心机、普通PCR仪。
（2）样品：细胞样品、组织样品等。一般新鲜取用，或者-80℃保存。
（3）试剂和耗材：①总RNA提取试剂Trizol Reagent（Invitrogen）；②氯仿，异丙醇：置于4℃；③配制75%乙醇：无水乙醇与RNase-free超纯水以3∶1体积比混合；④RNasefree的移液器吸头，RNase-free的EP管；⑤0.1%DEPC（焦碳酸二乙酯）处理水或RNasefree超纯水；⑥Agarose，新配TBE缓冲液，上样缓冲液（Loading Buffer）和DNA Marker；⑦逆转录试剂盒Takara RR037A：PrimeScript＠RT Enzyme Mix I（Takara）；⑧荧光定量PCR试剂盒Takara RR420A：SYBR＠Premix Ex Taq TM（Takara）；⑨PCR板：ABI MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode或Axgen PCR-96-AB-C。
2.方法（以检测实验样本基因表达变化为例）
（1）收集样品：50～100 mg组织或5×106细胞（见Trizol法抽提RNA）。
（2）总RNA提取：研磨组织／裂解细胞样品，Trizol处理，离心，沉淀，洗涤，溶解，测浓度（见Trizol法抽提RNA）。
（3）cDNA 合成：按逆转录试剂盒说明书进行。合成好的cDNA 以超纯水或TE 稀释5～10倍，分装，置于-20℃保存备用。
（4）引物设计与合成：以Primer-BLAST在线设计引物或找经验证的可靠的引物，联系生物技术公司合成。
（5）实时定量PCR：预实验构建标准曲线，摸底条件，确定定量方法（双标准曲线法或2-ΔΔCT法），再到正式实验。制作标准曲线的方法：梯度稀释cDNA（2～10倍稀释，设置4～6个梯度），以待测引物做PCR，得出曲线及相关系数、斜率、扩增效率。注意：此cDNA可以来自废样本或实验任一组、容易获得的样本，需要与实验组样本相同种属来源的，且有表达待检测的基因。具体荧光定量PCR参照试剂盒（如Takara RR420A）进行。20μl反应体系：2×SYBR＠Premix Ex TaqTM（Takara Ex Taq HS，SYBR Green I，PCR buffer，MgCl2，d NTP mixture）10μl；上游引物F 0.5μl，下游引物R 0.5μl；cDNA template 2μl，加超纯水补足20μl。定量PCR仪扩增反应条件设置：95℃1 min；95℃5 s～58℃15 s～72℃30 s（40个循环）。
（6）实时定量PCR数据分析：以检测实验样本Cnx43基因表达变化为例，构建Cnx43和β-actin的标准曲线，同时检测实验样本中这两个基因的表达（考虑到样本不多，这里没有按照先做预实验，再正式实验的步骤，而是同时进行，类似双标准曲线正式实验的方法）。分析步骤如下。
1）导出数据。
2）对各基因扩增参数逐项分析：先对每个基因按表8-5逐项分析。
表8-5 基因扩增参数分析项目
对于扩增曲线：Ⅰ曲线形态是否正常（四个时期）、平滑；Ⅱ起峰早晚（15＜CT值＜35）；Ⅲ梯度稀释模板的曲线：相同浓度的复孔，曲线是否接近重合（这与复孔间CT SD值相关）；不同浓度的曲线是否以相同间隔平行右移（图8-6A）。当按特定倍数梯度稀释模板然后进行PCR时，相应CT值的差值为恒定常数，其推导过程如下：
荧光量≈产物量
Y=X·2nR2：＞0.99
其中Y为产物量，X为起始拷贝数，n为循环数
达到相同产物量时，CT值的差值为定值：
(https://www.daowen.com)
当模板稀释3倍时（如9copy→3copy）：所以，梯度稀释模板进行PCR，相应的扩增曲线理论上以相同的间隔平行右移。对于标准曲线：要求为
Eff%：90%——100%——110%
Slope：-3.58——-3.32——-3.10
其中：
Slope≈3.3时，扩增效率为1，即100%
对于熔解曲线：单峰代表产物单一（参见荧光染料部分）。是否为目的基因特异产物，还需要primer-BLAST检测支持。
若是以上1项或多项不达标，则需对实验方案进行优化（参见实验方案优化部分）。
3）提取所有样本的目的基因和内参基因数据进行分析：对所有样品分别提取目的基因和内参基因数据，以2-ΔΔCT法（图8-8）或相对标曲法（图8-9）进行分析（对照样本48-Ctrl，实验样本48～106M 为药物以10-6 mol／L处理48 h后收样）：
图8-8 以2-ΔΔCT法对所有样本的目的基因和内参基因数据进行分析
图8-9 以相对标曲法对所有样本的目的基因和内参基因数据进行分析
（2-ΔΔCT法使用前提：目的基因和内参基因的扩增效率相同，接近100%且偏差在10%以内。若不在此范围内，就要使用相对标曲法分析）
4）作图：对数据进行统计分析，并作图（图8-10）。
图8-10 Cnx43与β-actin的mRNA表达量比值直方图
[使用2-ΔΔCT法分析数据，以Excel2007作图，Cnx43在48～106M 样本中（相对于48-Ctrl）表达显著降低，*P＜0.05]
3.实验方案的优化（以检测实验样本基因表达变化为例） 若扩增基因的扩增曲线、熔解曲线和标准曲线其中一项或多项不达标，则需对实验方案进行优化。主要从样本RNA 抽提方法标准化、RNA质控（包括RNA浓度、纯度、完整性）；cDNA 的逆转录及其在PCR体系中用量；引物的设计（兼顾特异性和扩增效率）；扩增试剂效价、扩增体系及条件、定量分析方法等方面进行优化。若目的基因和内参基因的扩增效率相同，接近100%且偏差在10%以内，可使用2-ΔΔCT法分析；若目的基因和内参基因的扩增效率达不到这个要求（其他方面符合要求），就要使用相对标曲法分析。
建议首次实验构建标准曲线，以一系列稀释浓度的模板（cDNA）进行荧光定量PCR，得出标准曲线、PCR反应扩增效率和扩增基因起始cDNA浓度相对大小，检查扩增体系、流程和条件是否合适，并利用熔解曲线、结合primer-BLAST分析判定产物的特异性，以便选择合适的定量方法、模板浓度和特异性引物及其他条件。在以cDNA为模板的PCR反应体系中，有建议提高Mg2+浓度到2～5 mmol／L。改善实时定量PCR引物设计（染料法）可参考表8-6。
表8-6 荧光定量PCR引物设计的原则（染料法）
