成骨细胞生物学研究方法
成骨细胞的分化和成熟可分为细胞增殖、基质成熟、基质矿化3个阶段，检测成骨细胞主要是针对这3个阶段。在细胞增殖过程中一些特定基质蛋白如前胶原蛋白Ⅰ，TGF-β和纤粘蛋白（fibronectin）可以被检测到；基质成熟阶段特征是碱性磷酸酶（ALP）的大量表达；在基质矿化阶段，骨钙素（osteocalcin，OC）和骨桥蛋白（osteopontin，OPN）等基因开始表达，形成的钙结节能够被茜素红（alizarin red）染色等观测。骨钙素又称骨R-羟基谷氨酸蛋白（Rhydroxy glutamic acid protein，GLa蛋白），是由49个氨基酸组成的多肽，由成骨细胞在成熟期合成，其主要功能是维持骨的正常矿化速率，是反映骨转换的重要指标。骨桥蛋白是约含有32 000个多肽糖基化的骨磷酸蛋白，存在于中轴骨和细胞外液、血浆、尿液及乳汁中。成骨细胞产生的基质分子主要是Ⅰ型胶原（collagen-Ⅰ，COL-Ⅰ），故COL-Ⅰ也是成骨细胞的标记物之一，在分化成熟整个阶段都可被检测到。
1.ALP活性检测鉴定 ALP几乎存在于各个组织，以骨骼和肾脏中含量较多。ALP促进成骨细胞成熟、钙化，定量检测可以反映成骨细胞的分化水平。ALP是成骨细胞成熟的早期标志，通常在第4天开始表达，在7～14天表达较高。ALP活性可通过如下方法定量检测。
（1）为了诱导成骨分化，配制含10 n M 地塞米松、10 m M 甘油磷酸和50μg／ml抗坏血酸的DMEM 骨分化培养液。
（2）成骨细胞用上述培养液诱导进入成骨过程。10天后去除培养基并用PBS进行洗涤，随后用被动裂解液裂解细胞。
（3）按照Lowry法，在p H 为10.3的情况下，以p-硝基酚磷酸盐为底物，在405 nm 波长下检测吸光度，计算出ALP活性。
（4）用BCA蛋白质分析试剂测定细胞裂解液中的蛋白质浓度。上述ALP活性再根据细胞裂解液中的蛋白质浓度标准化定量分析。
2.ALP染色
（1）成骨细胞成骨诱导方法如上所述，培养10天后用4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤3次。
（2）配制BCIP／NBT 染色工作液。5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐（5-bromo-4-chloro-3′-indolyphosphate p-toluidine，BCIP）和硝基四氮唑蓝（nitro-blue tetrazolium chloride，NBT）是碱性磷酸酯酶的常用底物，其显色机制是在ALP的催化下，BCIP会被水解产生强反应性的产物，该产物会与NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的NBT-formazan。
（3）在洗涤后的细胞中加入适量BCIP／NBT 染色工作液，确保能充分覆盖住样品，室温避光孵育30 min，可根据染色情况酌情增减染色时间。
（4）去除BCIP／NBT染色工作液，H2 O洗涤1～2次即可终止显色反应，晾干随后拍照。(https://www.daowen.com)
3.茜素红（alizarin red）染色 成骨细胞具有体外矿化的功能特征，经过成骨诱导后，一般在14～21天后成骨细胞可以形成肉眼可见的钙化结节，该结节可以通过茜素红法染色鉴定。
（1）成骨细胞成骨诱导方法如上所述，培养21天后用4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤3次。
（2）加入0.1%茜素红（p H 8.3）溶液，确保能充分覆盖住样品，室温避光孵育30 min，可根据染色情况酌情增减染色时间。
（3）蒸馏水冲洗染色液，晾干后显微镜下进行矿化结节观察，茜素红染色钙结节呈橘红色。
4.Von Kossa染色法
（1）成骨细胞成骨诱导方法如上所述，培养21天后用4%多聚甲醛固定15 min，H2 O 洗涤3次。
（2）加入5%硝酸银溶液，确保能充分覆盖住样品，将培养板开盖在紫外灯下照射1 h。
（3）去除硝酸银溶液，H2 O冲洗3次。
（4）加入5%硫代硫酸钠溶液1 ml中和残留的硝酸银溶液，去除后，H2 O冲洗3次并在室温下晾干。显微镜下进行矿化结节观察，Von Kossa染色钙结节中间呈黑色，周边呈褐色。
5.RT-PCR检测 OPN、OC、COL-Ⅰ等成骨标志性因子可以通过RT-PCR检测。成骨细胞成骨诱导方法如上所述，RT-PCR方法详见第八章。