PCR反应模板的制备
PCR反应的关键因素主要有引物的设计与选择、酶的质量和模板的制备，在前两者都稳定可行的情况下，PCR模板的制备尤为重要。模板处理方法的选择及操作人员的基本技能，决定分离模板核酸的质和量及PCR的成败，而提高模板核酸质量的关键是除去杂质（蛋白质、酶、脂肪等），除去抑制Taq DNA聚合酶活性抑制因子，提高模板核酸的产量。
传统的核酸模板提取方法是采用去垢剂如SDS等来溶解、破坏细胞膜，使蛋白质变性；用蛋白酶K来消化去除蛋白质，尤其是与DNA结合的蛋白质；再用酚-氯仿抽提；然后用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。目前发展了简便实用的标本消化处理方法（如碱裂解法），亦可满足PCR实验的要求。RNA模板提取一般采用Trizol法，要防止RNA酶（RNase）降解RNA。RNA 抽提还可使用离心柱法，代表产品是RNeasy Mini Kit（Qiagen），还有EZ-press RNA Purification Kit（EZBioscience）等。采用哪种方法消化、处理标本，视PCR实验的目的及环境条件而定。下面介绍三种实验中常用的模板核酸的提取制备方法。
1.蛋白酶K消化裂解法 适用于所有标本的消化处理，尤以DNA样品为佳，如组织细胞（包括石蜡包埋组织）绒毛、毛发、精斑、血液（血清、血浆、全血）、局部分泌物、尿、粪便等。
（1）试剂配制：①蛋白酶K消化液：10 mmol／L Tris-HCl（p H 8.0），10 mmol／L EDTA，150 mmol／L NaCl，0.5%SDS，100～200μg／ml蛋白酶K；②蛋白酶K 可先用超纯水配成20 mg／ml，临用时加入消化液中。
（2）提取方法：有些标本在用蛋白酶K 消化前，还需预处理，如粪便、分泌物、痰液、组织块、石蜡包埋组织等，其方法有剪碎、离心去掉杂质、脱蜡等。
标本或经预处理的标本加蛋白酶K 消化液50～100μl（蛋白酶K 终浓度100μg／ml）混匀，55℃消化2 h（或过夜），15 000 g离心10 min；加等体积的Tris饱和酚，充分混匀，15 000 g离心5 min；取上清液加等体积的氯仿：异戊醇（24∶1），充分混匀，15 000 g离心5 min；上清液加入1／10体积的p H 5.2的3 mol／L醋酸钠溶液，加入2.5倍体积的冰冷无水乙醇（或加等体积的异丙醇）-20℃放置30 min。取出后15 000 g离心15 min，小心吸弃或倒出上清液，沉淀加入75%冰冷乙醇颠倒洗涤，7 500 g离心5 min，特别小心的吸弃上清液，室温干燥，加TE（Tris-EDTA）缓冲液20μl。溶解后，取2μl用于PCR扩增，或放于-20℃保存。
蛋白酶K消化法除上述经典处理法外，亦可在蛋白酶K消化处理标本后，离心处理，吸取上清液，经95～97℃或煮沸10 min灭活蛋白酶K，直接做核酸模板用于PCR扩增。如杂质较多，还可经酚-氯仿抽提后，再用于PCR反应。该法对蛋白质及其他杂质消除彻底，Taq酶活性不受影响，具有良好的重复性与稳定性，但操作繁复、技术要求高。
2.碱变性法 剪1～2 mm 鼠尾／鼠耳于1.5 ml离心管中，加入75μl碱性裂解液（NaOH 25 m M，EDTA 0.2 m M），95℃孵育20～30 min后，加75μl中和液（Tris-HCl 40 mmol／L），混合离心后，将上清液转移到新的1.5 ml离心管中，4℃（短期）或-20℃（长期）保存。取上清液2μl，用于20μl PCR扩增体系。
3.Trizol法 该法主要用于RNA的提取，标本为组织、细胞等，流程如下。
（1）裂解细胞：若是组织取50～100 mg，加入1 ml Trizol，匀浆器或是研磨仪按说明书操作，将匀浆／研磨好的样品装入RNase-free的Eppendorf管中。若是细胞，每（1～5）×106细胞加入1 ml Trizol，吹打均匀，使充分裂解。
（2）液相分离：震荡混匀，冰上静置5 min。每1 ml Trizol加入200μl氯仿（1／5体积），盖紧盖子，充分震荡15 s混匀，冰上静置5 min，静置分层。4℃，15 000 g离心15 min，混合物分为下层的红色苯酚-氯仿相、中间的蛋白质沉淀和上层的水相，RNA 即位于上层水相，水相约占60%。
（3）RNA沉淀：将上清液转移到一个新的Eppendorf管中，加入等体积的预冷的异丙醇，震荡10 s混匀，冰上静置10 min。4℃，15 000 g离心10 min，RNA沉淀为小团块状物质[如果没有沉淀或沉淀很少，可以尝试加入1／10体积的醋酸钠（3 mol／L，p H 5.2），充分震荡，冰上静置10 min，再同以上条件离心]。
（4）RNA洗涤：去掉上清液，加入等体积75%乙醇洗涤，每1 ml Trizol加入1 ml乙醇。颠倒洗涤后，4℃，7 500 g，离心5 min，小心吸弃乙醇。
（5）RNA溶解：室温静置，自然控干RNA 沉淀小块（透明化即可，注意不要过分干燥）。溶解在30μl DEPC水中，吹打静置，充分溶解。-80℃保存。
（6）RNA纯度和完整性检测：取2μl稀释50倍，以紫外分光光度计测其OD260（可换算为浓度）、OD260／OD280、OD260／OD230。对于纯RNA，OD260／OD280=2.0，一般在1.8～2.0可以接受，若＜1.8，可能有蛋白质污染；若值异常高，可能是空白组消除了OD280信号所致。而OD260／OD230在2.0～2.4为正常，若＜1.8说明存在有机化合物（苯酚、盐酸胍、EDTA）等污染。
同时，用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量（完整性）。电泳槽和用于配胶的板先洗干净，新鲜配制琼脂糖（Agarose）胶（浓度1%）、TBE缓冲液，一般上样0.5～1μg（用RNase-free的枪头），电泳时间10～15 min，电压8 V／cm 电极距，其他与DNA凝胶电泳相同。
RNA跑胶结果分析（图8-3）：电泳只能看到3条带：28S、18S和5.8S、5S。与DNA Marker比较，28S大概在2 K 左右，18S大概在0.8 K 左右，5.8S和5S用琼脂糖是分开不了的，只是一条很弱的条带，在100 bp左右，完整性好的RNA其28S亮度是18S的2倍。
3条条带清晰，28S是18S亮度2倍，5S和5.8S最弱，显示RNA完整性良好（A）；未见3条条带，100 bp位置有超亮条带，显示RNA 已降解（B）。材料：小鼠细胞RNA，用量1μg。1%Agarose，电压120 V，电泳15 min（电极距离15 cm）。
图8-3 RNA完整性检测
（7）逆转录（reverse transcription）：是以RNA为模板合成DNA的过程。以样本中提取的mRNA为模板（通过Oligo d T primer与Random primer），在逆转录酶的作用下，合成出互补的cDNA（complementary DNA）（图8-4）。
图8-4 逆转录酶催化的cDNA合成示意图
以Takara cDNA逆转录试剂盒（DRR037A）为例（表8-4）：将上述反应体系混匀离心。普通PCR仪上设置程序：37℃孵育15 min；85℃孵育5 s。放置样品，开始运行。结束后，-20℃保存样品。
表8-4 20μl逆转录（RT）反应体系
