淋巴细胞亚群分析
1.原理 很多免疫细胞会表达一些特殊的抗原标记物，这些抗原可以是细胞表面抗原（如比较常见的CD3、CD4、CD8），也可以是胞内抗原（如Th17细胞的IL17胞内因子）和核内抗原（如Treg细胞特异表达的Foxp3转录因子）。利用流式技术多色分析的特点，通过不同的荧光素偶联抗体标记细胞，就能特异性地识别某群细胞，并能进一步鉴定该群细胞的不同亚型，也可以检测某一亚群细胞上某种抗原的表达量。以淋巴细胞亚型分析为例，人外周血常见的淋巴细胞群为T、B和NK 细胞，常用的标记物分别为CD3、CD19／CD20和CD16／56（表11-3），T细胞可以进一步分为CD3+CD4+Th细胞和CD3+CD8+Tc细胞，本实验通过表面标记物还能进一步分析CD4+CD25+CD127-／low的调节性T细胞（Treg细胞）。
表11-3 淋巴细胞亚群分析标记抗体选择及荧光素搭配
2.方法、流程
（1）取11个流式管（分别标记空白管、9个单染管和sample管），分别取100μl抗凝血，加入2 ml 1×红细胞裂解液，室温裂解10 min，400 g离心5 min。
（2）去上清液，混匀细胞沉淀后，加入2 ml PBS缓冲液洗，400 g离心5 min洗涤1次。
（3）去上清液，混匀细胞沉淀，剩余约100μl细胞悬液可以直接标记抗体，如表11-4。
表11-4 流式抗体加样表示例
（4）混匀后，避光4℃，孵育30 min。
（5）加入2 ml PBS缓冲液洗涤1次，400 g离心5 min。
（6）去上清液，加入200～500μl PBS缓冲液重悬细胞后上机检测，如果不能立即检测，可以加入200μl 0.5%多聚甲醛固定液，4℃避光保存。(https://www.daowen.com)
（7）上机前，一般先通过Blank管调节电压，尽量把阴性信号调到流式图的左下位置。
（8）分别上单染管调节补偿。
（9）上sample管直接记录数据。
3.结果分析 图11-22 a图首先通过FSC-A／FSC-H 的二维图，圈出对角线位置的单个细胞（去除粘连体），b图进一步圈出死活（Live／Dead）细胞染料阴性的活细胞进行分析（去除死细胞）；c图圈出的CD45+的为所有的白细胞，d图通过散射光FSC／SSC图，能找到典型的淋巴细胞群体；淋巴细胞中，可以检测到CD19+的B细胞（e图）、CD3+的T细胞和CD16／56+的NK细胞的百分比（f图）；T细胞中，通过CD4／CD8的伪彩图，能分析得到CD4+CD8-的Th细胞和CD4-CD8+的Tc细胞（g图），Th细胞中能进一步分析CD25+CD127-／low的Treg细胞亚型（h图）。
图11-22 淋巴细胞亚群分析设门流程
4.注意事项
（1）本实验是以占用9个荧光通道（9色）的实验为例，具体实验应根据需求和仪器配置挑选需要的参数、荧光素抗体。
（2）本实验使用红细胞裂解液裂解红细胞，加入的不等渗的氯化铵溶液能破坏红细胞，注意裂解液的体积和裂解的时间需要摸索，建议提前做好预实验。
（3）多色实验中，每种抗体需要提前滴定摸索最佳的使用量，本实验仅按照抗体生产商推荐的用量。
（4）单染管调节补偿需要有阳性信号才能调节，死活细胞染料如果死细胞太少没有阳性信号，可以采取样本70℃热水煮3～5 min的方法。
（5）本实验分析的是常见的免疫细胞表型抗原，阴性和阳性分群清晰，故没有准备同型对照和FMO对照，具体实验中可以根据需求设置对照组。