电镜下观察自噬性结构——自噬检测的金标准
1.自噬的形态学特征 透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）是观察自噬现象最直接、最经典的方法。自噬是动态持续的过程，依次形成特殊的结构：自噬前体、自噬体、自噬内涵体、自噬溶酶体（图16-3）。
图16-3 典型的自噬体和自噬溶酶体结构
a～c.自噬体（箭）；d.自噬溶酶体（双箭）。M：线粒体，N：细胞核，ER：内质网，标尺=500 nm
[图片来源：王自彬，王静，王玲，等.自噬小体的超微结构分析[J].南京医科大学学报（自然科学版），2016，36（4）：426-429]
（1）自噬前体特征：新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。
（2）自噬体特征：双层膜或多层膜的液泡状结构，内含形态完整的未消化的胞浆成分或细胞器（如线粒体、内质网片段），并未与溶酶体融合。
（3）自噬内涵体特征：通过自噬体和（或）自噬泡内所表达的小的内部囊泡识别出来，这些内部囊泡通过与多泡核内体融合交付到内腔。
（4）自噬溶酶体特征：通常仅有一个限制膜，包含细胞质和（或）降解水平不等的细胞器。一般来说，降解的物质电子密度会增加，形成黑色颗粒状或不定型的聚集。
在实际操作时，如没有特殊的标记比较难区分自噬体、自噬内涵体和自噬溶酶体等不同结构。可根据其内容物的结构完整情况大致用初始自噬囊泡（Avi）和降解自噬囊泡（Avd）来表示，其中Avi内含的胞浆物质结构完整，Avd内容物则被不同程度降解（图16-4）。
图16-4 初始自噬囊泡（Avi）和降解自噬囊泡（Avd）
（图片来源：http：／／www.gznovabio.com／up Load／image／20170509／14943020011989011.jpg）
2.样品取材与固定的注意事项 进行自噬检测时需注意分析样本的选择，对不同样本采取相应处理方式是自噬研究中TEM 检测成功的关键。
（1）取材前准备工作：由于戊二醛固定液影响抗原性，若在动物实验研究中还需进行免疫学实验，则建议每组另单独准备动物进行电镜观察。对于未进行灌流固定的动物优先进行电镜标本的取材，以免组织自溶而影响超微结构的观察。取材时，相同人员平行操作，可分别平行取每一组相同序号的动物。一般每组动物至少取3份标本，避免个体差异，增加结论的可靠性。
1）固定液的选择：固定的作用是在分子水平上使细胞保持存活状态的超微结构，减少细胞死亡后的变化。一般细胞固定液为2.5%戊二醛（glutaraldehyde solution），组织固定液为4%戊二醛，灌流固定选用3%多聚甲醛、1%戊二醛。固定液的p H 在7.2～7.4，与被固定的组织酸碱度基本一致。若不一致，则会改变蛋白质等大分子物质的结构和性质，影响细胞质的化学成分、膜的大分子排列及酶的生物活性。(https://www.daowen.com)
2）实验器械、标本固定容器的准备：组织需充分与固定液接触，则固定效果较好；容器最好为底面积比较大的小瓶；对取材用器材及试剂，进行清洁及预冷，写好取材的标签。
（2）取材
1）组织标本的取材原则：取材遵循快、小、轻、准、冷五原则。
快：组织在断血1 min内浸入固定液。必须目标明确动作迅速，时间过长，会出现细胞内溶酶体膜破裂，组织自溶。
小：没有方向的组织一般取材尺寸为1 mm×1 mm×1 mm，有方向的组织以1 mm×1 mm×3 mm为宜，3 mm 为长轴的方向。固定液的穿透能力只有0.5 mm，若样品过大会使内部固定不良；但若样品过小时观察的目标将受到局限。
轻：取材刀片须锋利，操作应始终保持动作轻柔。只做直线切割，避免对组织的挤压及拉锯，以免引起组织结构的人工损伤性变化。
准：部位准确可靠，根据研究目的考虑定位和定向的问题。
冷：为了降低水解酶的活性，尽量在低温下操作、保存、送样。所用容器和器械应预冷，取好的标本放在4℃冰箱保存。送样时最好放到冰盒里，但应注意在小瓶与冰之间隔开，以免固定液结冰，破坏细胞结构。
2）取材具体操作：①将动物急性处死（或麻醉），暴露出所需器官，剪取一小块组织，放入预冷的4%戊二醛固定液中。②取出快速转移至冰盒上，滴1滴预冷的固定液，用双面刀片将材料切成1 mm 宽、2～3 mm 长的小条，对于没有定向要求的标本再将其切成约1 mm3左右小块。③将组织块逐一放入装有戊二醛溶液的小玻璃瓶中。放入4℃冰箱，固定2～4 h。④从戊二醛中取出组织，经PBS缓冲液漂洗后，转移至1%锇酸（osmium tetroxide）中后固定，4℃，2～3 h。梯度丙酮（分别50%、70%、90%、100%）逐级脱水。⑤无水丙酮3次脱水后，渗透液按（无水丙酮∶环氧树脂）2∶1、1∶1、1∶2的比例逐步渗透，最后为纯环氧树脂渗透包埋，烘箱聚合（37℃12 h，45℃12 h，60℃48 h）。⑥超薄切片机切片，厚50～70 nm，醋酸双氧铀-柠檬酸铅双重染色，制片成功后，透射电镜观察并拍照。
3）培养细胞的取材固定：收集细胞的数量因细胞体积的大小而定，一般（2×106）～（5×106）即可。收集悬浮细胞时，将含有细胞的培养液转移入离心管离心。贴壁细胞先将细胞从培养瓶（皿）上轻轻刮下来或用胰酶消化下来，收集到离心管中离心。为了获得更理想的超微结构，可在离心前加入等量的2.5%戊二醛，再进行离心。不同细胞离心转速和时间不同，应查阅文献进行确定。弃上清液后沿管壁缓慢加入固定液，在4℃冰箱内静置固定1～2 h，然后送样。若固定后，在送样时又散开，且再次离心不易成团，可以弃固定液，加入小滴10%牛血清白蛋白，再离心成团，再弃上清液加固定液送样。
（3）注意事项
1）普通透射电镜切片在制备过程中的处理可影响膜脂质成分，切片上的自噬体并非都是两层膜结构。有时可能仅有一层膜，也可能是多层膜，有时膜结构因为脂质被提取而无法辨认。因此，是否存在双层界膜不能作为识别自噬体的依据。
2）避免将其他细胞器与自噬体混淆。细胞内存在多种膜结构的细胞器，在生理和病理状态时表现不同，极易与自噬体相混淆。粗面内质网有时会包绕线粒体等细胞器，容易误认为自噬体。其嵴脊有时在电镜切片上可形成杯状或环状结构，酷似自噬体。可根据内质网上有核糖体结构而自噬体膜上无核糖体鉴别。另外，线粒体也是含双层界膜的细胞器，肿胀或含有沉淀物的线粒体外观与自噬体形态相似。但线粒体两层界膜间距一般较小且均一，线粒体内膜折叠形成嵴，而自噬体内膜不会折叠。
3）电镜观察仅能证明自噬性结构的存在，难以反映自噬活性的强弱。切片上的电子密度低或空泡有时会被误认为自噬囊泡。目前发展出免疫金电镜技术来对电镜结果进行定量分析，以图像分析软件自动测量所有自噬囊泡的面积。在结合其他检测方法的基础上，如细胞胞浆中被自噬性囊泡所占据的总面积增加，则可说明自噬机制的上调。