荧光补偿调节
荧光补偿（compensation）是指在流式细胞多色分析中，纠正荧光素发射光谱重叠（spectral overlap）的过程，即从一个被检测的荧光信号（通道）中去除任何其他的干扰荧光信号的过程。正确调节各荧光通道之间的补偿，对流式分析结果影响很大。
1.补偿调节的原理 流式荧光通道之间需要调节补偿是因为流式荧光素在相应激光激发后发射的荧光波长并不集中于一个很小的范围，而是或多或少会渗漏的其他通道之中。要排除这些渗漏荧光信号的干扰和误导，就需要纠正这些通道的荧光信号值。例如，同时使用FITC荧光素偶联抗体1和PE荧光素偶联抗体2标记细胞，FL1通道接收到的荧光信号代表FITC荧光素的信息，此时FL1通道也称为FITC通道；FL2通道接收到的荧光信号代表PE荧光素的信息，也称为PE通道。但FITC通道接收到的荧光信号不都是来自FITC荧光素，也有一部分来自PE荧光素的渗漏；PE通道接收到的荧光信号不都是来自PE荧光素，也有一部分来自FITC荧光素的渗漏。
如图11-15所示，FITC通道收集的荧光波长范围在515～545 nm，除了大部分来自FITC荧光素的发射荧光，还有少部分来自PE荧光素的发射荧光。PE通道收集的荧光波长范围在562～588 nm，除了大部分来自PE荧光素的发射荧光，还有少部分来自FITC荧光素的发射荧光。所以就需要把FITC 通道中来自PE 的发射荧光扣除（FITC 通道荧光值-x%PE通道荧光值），让FITC通道只显示FITC发射荧光的强弱；需要把PE通道中来自FITC的发射荧光扣除（PE通道荧光值-x%FITC通道荧光值），让PE通道只显示PE发射荧光的强弱。
图11-15 FITC、PE的发射荧光分别渗漏到PE通道、FITC通道
2.补偿调节的方法和流程 在调节补偿时，一般使用发生渗漏的荧光素的单染管调节渗漏到的那个通道的补偿。例如，在扣除PE通道中来自FITC荧光的渗漏时，要使用FITC荧光素偶联抗体1的单染管；在扣除FITC通道中来自PE荧光的渗漏时，要使用PE荧光素偶联抗体1的单染管。使用PE单染管调节FITC通道的补偿时，要把FITC通道中来自PE的发射荧光扣除，就用FITC通道荧光值-x%PE通道荧光值，X就是一个调节的变数。
如何准确扣除FITC通道中渗漏进的PE发射荧光？在FL1-FL2（即FTIC-PE）散点图中，如图11-16a所示，左下角圆圈代表阴性细胞群。而标记PE的上方圆圈为PE单染的细胞群，本来应该在阴性细胞群的正上方、竖直方向，代表PE通道的阳性细胞群，却因为PE荧光素泄漏到FITC（FL1）通道，发生向右偏移，产生FITC通道阳性荧光（细胞群）。在用FITC通道荧光值-x%PE通道荧光值时，随着X 值的尝试性逐渐增加，该细胞群（标记PE的圆圈）就会向左移动，当该细胞群移到阴性细胞群的正上方即竖直方向时，即表示准确扣除了FITC通道中渗漏进的PE发射荧光，用PE单染管调节FITC通道补偿完成（图11-16b）。用FITC单染管调节PE通道补偿也是类似。(https://www.daowen.com)
图11-16 FITC单染管调节PE通道补偿与PE单染管调节FITC通道补偿的叠加图
补偿前（a）；补偿后（b）
图11-16a中，标记FITC的右方圆圈为FITC单染的细胞群，本来应该在阴性细胞群的正右方、水平方向，代表FITC通道的阳性细胞群，却因为FITC荧光素泄漏到PE（FL2）通道，发生向上偏移，产生PE通道阳性荧光（细胞群）。在用PE通道荧光值-x%FITC通道荧光值时，随着X值的尝试性的逐渐增加，该细胞群（标记FITC的圆圈）就会向下移动，当该细胞群移到阴性细胞群的正右方，即水平方向时，表示准确扣除了PE通道中渗漏进的FITC发射荧光，用FITC单染管调节PE通道补偿完成（图11-16b）。
补偿调节准确的标准是：散点图X轴或Y轴上的阳性细胞群与阴性细胞群位置的“横平或竖直”，多退少补。在流程上，一般双色染色的实验时，①先用阴性管调电压，阴性管中细胞不加抗体（或加各个抗体的同型对照，如Rat IG2b）；②再用单染管调补偿，单染管中细胞+抗体A-FITC或抗体B-PE；③再上各实验组的样品管。
除了使用样品细胞做单染管、调补偿之外，还有专门的补偿微球用于调补偿。这在样品细胞有限，或抗原标记低表达时，尤其有用。现在有CompBeads系列（BD）和OneComp ebeads、UltraComp eBeads系列（Invitrogen）等产品可用。