基于自噬体标记蛋白LC3的检测方法
1.利用蛋白质免疫印迹检测LC3-Ⅱ蛋白的水平或LC3-Ⅱ／Ⅰ比值的变化评价自噬形成 自噬过程由一系列自噬相关蛋白质（Atg蛋白）介导完成。自噬体膜上标志性蛋白质——微管相关蛋白1的轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3），是酵母菌自噬基因（Atg8）在哺乳动物中的同源物，被认为是自噬体典型的标志蛋白质。LC3是泛素样蛋白，在合成后其C端即被Atg4蛋白酶切割变成-Ⅰ，LC3-Ⅰ散在分布于胞浆内，其分子量为18 kD。当自噬形成时，LC3-Ⅰ酶解转化成为膜型LC3，其分子量为16 kD，和磷脂酰乙醇胺（PE）偶联形成LC3-Ⅱ并定位于自噬体内膜和外膜。与其他一些定位于自噬性结构膜上的Atg蛋白不同，LC3-Ⅱ始终稳定地保留在自噬体膜上直到与溶酶体融合（图16-5）。
图16-5 LC3系
自噬发生后，通过蛋白质免疫印迹可检测到两个条带的蛋白质。LC3-Ⅱ与PE结合后实际分子量大于LC3-Ⅰ，但由于其疏水性较强，在SDS-PAGE电泳的泳动速度要快于LC3-Ⅰ。在实际检测中，LC3-Ⅰ与LC3-Ⅱ分别位于16 kD、14 kD部位。由于LC3-Ⅱ与自噬小体／自噬溶酶体的数量呈正相关，因此被广泛应用于定量细胞自噬的活性。在哺乳动物细胞中，自噬时一般LC3蛋白总表达水平并无上调，而是一部分LC3-Ⅰ转变成了LC3-Ⅱ。理论上自噬时表现为LC3-Ⅰ的减少和LC3-Ⅱ的增加，通过LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ含量和比值即可反映自噬水平。但由于两者对抗体结合能力存在差异，导致检测敏感性不同（LC3-Ⅱ检测敏感性高于LC3-Ⅰ）。实际结果中，LC3-Ⅰ的减少往往并不与LC3-Ⅱ的增加同步。因此有学者认为单纯比较LC3-Ⅱ蛋白的水平可能更合适。而比较LC3-Ⅱ的水平，也仅能反映自噬体的数量，表达的多少并不意味着自噬活性的强弱。当细胞自噬活性很强、自噬体降解速度很快时，可能检测不出LC3-Ⅱ蛋白的表达，或仅有很弱的表达，这种情况下的结果解释为自噬活性减弱就不合适。
还需注意：①LC3在哺乳动物细胞中可表现为4种亚型，分别为LC3A、LC3B、LC3B2和LC3C，这些亚型在不同的组织分布，可能需要运用不同的抗血清或抗体区分这些亚型。②虽然LC3-Ⅰ或LC3-Ⅱ含量水平的评估对于揭示自噬是必要的，但前者到后者的转变是细胞形态的特殊性，两者关系并不总是很清晰。LC3-Ⅱ的积累可通过阻断自噬体-溶酶体融合这个步骤获得。(https://www.daowen.com)
2.细胞免疫荧光示踪自噬形成 LC3-Ⅰ在胞浆内弥散分布，LC3-Ⅱ聚集于自噬体膜上，可通过免疫荧光方法示踪LC3的表达。利用转染技术，LC3与绿色荧光蛋白（GFP）结合成LC3-GFP可显示与LC3相同的过程。基础状态下，LC3-GFP融合蛋白弥散在胞浆中；自噬诱导后，LC3-GFP融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点。理论上，观察到点状聚集的数目即为自噬体的数量，根据点状聚集的密集程度可评价自噬活性的高低。但这种方法仅从总体上大致反映自噬的增加或减少。GFP-LC3融合蛋白表达增加（绿色斑点增多）并不一定与诱导自噬有关，也可能与自噬溶酶体降解受阻有关（图16-6）。
图16-6 细胞自噬诱导后GFP-LC3表达
[图片来源：Daniel J.Klionsky，Fabio C.Abdalla，Hagai Abeliovich，et al.Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy[J].Autophagy，2012，8：4，445544.图示为U87细胞分别以PBS，Rapamycin（200 n M），
Rapamycin与3-MA（2 mM）共处理24 h，GFP-LC3（绿色）在细胞中的表达情况，DAPI染细胞核为蓝色]
由于在正常细胞中也会观察到少量的点状聚集，需要制定标准来界定细胞内有多少点状聚集算是发生了自噬。采用计算机软件采集点状聚集信号进行分析，以细胞群中平均每个细胞所含的点状聚集数目或点状聚集的总面积作为定量指标，但该方法存在一定的假阳性。内源性LC3有时会同时表达促聚集蛋白质，而当转染（特别是瞬时转染体系）的GFP-LC3基因表达量太高时可能造成非特异性聚集。可同时构建一个LC3蛋白C端甘氨酸突变的GFPLC3转染体作为阴性对照，因为该C端突变的LC3蛋白不能够与PE 结合，因此可有效地消除非特异性聚集的影响。另需注意：检测整个细胞群的LC3时，也包括没有被转染的细胞。如果转染率太低，有必要运用其他方法，如运用荧光显微镜检测单细胞自噬。