（二）电泳

（1）安装垂直电泳装置（需检查是否漏水）。

（2）配10%分离胶（按前述配方配制。白蛋白抗体为67 kD，故用10%浓度），灌胶约2／3体积，用纯水液封（或用异丙醇或正丁醇，目的是封住胶面，促使聚合并使凝胶表面平直）。待凝后倾去液封的水。

（3）配4%堆积胶（按前述所列配方配制），灌胶至平板顶部，插入梳子。待凝后，拔出梳子，倒入电泳缓冲液。

（4）上样，接通电源，适当稳压（如80 V）电泳，样品被压缩成一条线，之后样品分离。当指示剂（LB中的溴酚蓝）到达平板底端的时候停止电泳（图9-9）。

（5）以采用PVDF膜为例：准备3个平底容器，一个装甲醇，一个装纯水，另一装转移缓冲液（若采用NC膜，则准备2个容器，一个装纯水，另一装转移缓冲液）。

图9-9　上样示意图(https://www.daowen.com)

（6）轻轻剥取分离胶，并将其浸入转移缓冲液中约5 min。

（7）裁剪PVDF膜（大小略小于胶或与胶齐平），将其浸入甲醇中约5 s，再浸泡于纯水中约5 min，然后放入转移缓冲液中平衡（若采用NC膜，则将膜浸泡于纯水中约5 min，再放入转移缓冲液中）；裁剪滤纸（大小略小于胶或与胶齐平），预先浸泡在转移缓冲液中；将海绵也预先浸泡在转移缓冲液中。

（8）按顺序安装好转膜装置（黑色板—海绵—滤纸—凝胶—杂交膜—滤纸—海绵—透明板，俗称三明治装置）。并完全排除气泡，4℃（或冰浴条件），300 m A 恒流转膜60 min（电流大小、转膜时间可根据蛋白质大小调节，一般最大电流为400 m A，过高容易产生热量使凝胶变形）。

（9）倾去转膜缓冲液，拆除转膜装置，取出膜。

（10）将杂交膜放入丽春红溶液中摇床染色约5 min，用铅笔标出Marker位置，再用纯水震荡以去除浮色。在上角剪去一角以辨上下左右。若用预染Marker，则能显示转膜是否成功，可不用此步判断。

（11）洗膜缓冲液（PBST或TBST）洗膜5 min，将膜转移至另一容器中，用5%脱脂奶粉封闭1 h（可用室温或37℃条件）。