（二）连接反应

（1）按照表12-4所示在200μl PCR管或1.5 ml EP管中配置连接反应体系，注意将T4 DNA连接酶最后加入。一般按照质粒和PCR产物的物质的量（mol）比值为3∶1的比例进行连接反应。按照“1 pmol 1 000 bp DNA为0.66μg，1μg 1 000 bp DNA的物质的量为1.52 pmol”的计算公式加入一定体积的质粒和PCR 产物（也可以利用网络工具进行快速换算，如Promega公司的提供的Biomath Calculators：https：／／www.promega.com.cn／resources／tools／biomath／等）。

表12-4　连接反应体系

（2）配制好以上反应体系后，使用移液器充分混匀，并瞬时离心将所有液体离心到管底。

（3）对于黏性末端的连接反应，可将管子放在16℃水浴锅中过夜进行孵育，或室温反应10 min就可。对于平末端的连接反应，16℃水浴锅中孵育2 h即可。

（4）反应后，将管子放到65℃水浴锅中，热失活处理10 min。(https://www.daowen.com)

（5）失活后的反应管放置于冰上。

（6）全部或只吸取1～5μl的失活后的反应溶液转化100μl大肠埃希菌感受态，轻轻混匀，冰浴10 min。

（7）向EP 管中加入400μl不含抗生素的LB 培养基，37℃摇床220 rpm 振荡培养20 min。

（8）吸取100～200μl菌液涂在含有氨苄青霉素或卡纳霉素抗性的LB平板上，倒置于37℃培养箱中，过夜培养（12～16 h）。

（9）过夜培养后，挑取转化子继续摇菌过夜培养，培养得到的菌液抽提质粒，进行重组质粒的酶切鉴定或测序鉴定（操作参见本章“质粒的转化、扩增、抽提与鉴定”）。