Cre／LoxP技术的原理与步骤
Cre／LoxP系统一般需要两种小鼠进行杂交。第一种小鼠体内有特定的LoxP位点，第二种小鼠则含有Cre酶，其表达受特定启动子控制。
Cre／LoxP系统通过同源重组方式将两个LoxP位点标记在胚胎干细胞中的特定靶基因序列的两端，再使用显微注射技术将同源重组成功的胚胎干细胞注射到囊胚内形成嵌合体胚胎，最终通过对子代小鼠进行基因型鉴定获得携带有LoxP位点的小鼠。图13-1中，通过设计胚胎干细胞基因打靶同源臂，进行干细胞的基因打靶，鉴定阳性克隆，将阳性克隆显微注射到囊胚中，将囊胚细胞移植到小鼠的子宫中，发育成转基因的小鼠。同时，将带有特异启动子的Cre重组载体注射到小鼠囊胚内，通过鉴定子代小鼠而获得Cre工具鼠。
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图13-1 Cre/LoxP小鼠构建步骤示意图
将Cre酶工具鼠与flox小鼠交配，通过鉴定子代小鼠就可以得到LoxP之间的DNA序列被删除掉的突变小鼠。Cre／LoxP系统不但可以进行基因的删除，还可以实现对基因的特异性激活，在LoxP位点之间插入poly A 序列可以使特定基因处于转录抑制状态。当带有Cre酶的动物与这样的动物进行交配时，Cre酶可介导删除poly A，从而实现对基因的激活。根据基因组序列设计LoxP位点，LoxP位点两端有同源的基因组序列，将含有LoxP位点的外源基因通过同源重组的方式在基因组上进行整合。因此，Cre／LoxP系统不但可以实现对外源基因重组进入小鼠的基因组，还可以将小鼠的内源性的基因删除掉。图13-2中，a图表示Cre重组酶识别LoxP位点34个碱基的DNA序列。b图表示利用LoxP和Cre驱动小鼠进行条件突变的育种策略。一只小鼠有组织特异性的Cre基因，另一只小鼠有LoxP等位基因基因Y，Cre重组酶的表达切断了LoxP位点并使基因Y失活。
图13-2 Cre-LoxP系统的作用机制
除通过小鼠交配实现基因敲除和激活，还可以使用特定的质粒或病毒系统对小鼠的特定组织进行转染和感染。例如，使用四环素或他莫昔芬（图13-3b，c）来调控Cre／LoxP的表达，可实现更好的基因表达的时空和基因拷贝数的调控。图13-3a中，他莫昔芬诱导的雌激素受体融合系统在不含他莫昔芬的情况下，融合蛋白Cre、ER与热休克蛋白HSP90相互作用，存在于细胞质中。他莫昔芬会破坏HSP90与Cre／ER的相互作用。ER与Tam 的相互作用使Cre入核。在细胞核中，Cre识别LoxP位点，并使组织X中的基因Y失活。图13-3b和c为表示四环素诱导的（Tet）开关系统。图13-3b在Tet-on系统中，普遍存在或组织特异性表达启动子驱动的rt TA。在缺乏Dox的情况下，失活的rt TA不能与tet结合序列，Cre不能表达。Dox存在时，活化的rt TA 与Cre的tet启动子结合并诱导Cre的表达。图13-3c在Tet-off系统在无Dox的情况下，激活的t TA能够结合Cre的tet O7（TRE）序列，诱导Cre的表达。四环素存在时，t TA与Dox相互作用失效。失活的r TA 不能与tetO7启动子结合，因此Cre表达被抑制。
图13-3 诱导性Cre-LoxP突变系统的原理