CRISPR／Cas9的识别和切割DNA的机制
CRISPR／Cas9系统的工作原理是crRNA将Cas9复合物靶向到靶标序列，tracrRNA和crRNA结合并与Cas9核酸酶形成复合物。由Cas9核酸酶切割特定的靶序列，实现特异性的DNA 双键断裂。tracrRNA 转录产物的主要作用是稳定结构。cr RNA 通过碱基配对与tracrRNA 结合形成tracr RNA／crRNA 复合物，指导Cas9蛋白在目标位点进行酶切，从而剪断DNA 双链。tracrRNA 和crRNA 可以形成单链RNA 导向RNA（single guide RNA，sgRNA），实现对靶标DNA的配对。sgRNA与靶基因序列互补配对，其结合与特定位点同时还需要邻近的短DNA序列，这样的短DNA序列称为原型间隔相邻基序（protospacer adjacent motif，PAM）。tracr RNA 和cr RNA 的基础部分连接形成sgRNA，sgRNA 与靶标DNA 配对，编程靶向目的序列，唯一的限制是sgRNA的结合位点必须与短PAM 基序相邻。
在PAM 处人工设计sgRNA，Cas9核酸酶在sgRNA 引导下切割靶序列，导致DNA 双链断裂。Cas9对特定的DNA序列进行特异性切割时，切割染色体DNA，产生位点特异性DNA双链断裂。细胞内的DNA 修复机制（HDR，MMEJ，HNHEJ）可以对特定的DNA 序列进行同源修复或非同源的修复，这种修复机制会带来基因的缺失或移码，从而实现靶基因的失活。
与ZFN和TALEN 相比，Cas9是利用小分子RNA 与靶标DNA 进行配对，靶标位点的DNA主要依赖DNA和RNA 序列的配对。CRISPR／Cas9系统操作相对简单，成本低，效率高，可同时对多个靶点进行操作。系统中因为在同一染色体中有两个不同的靶向sgRNA 基因座，可以显著提高重组效率，在基因组大片段的基因编辑方面效率显著提高。
CRISPR／Cas9与两个sgRNA共同使用，是操作大基因片段的简单而有效的方法，可以加速动物模型的产生，有利于建立更好的研究疾病模型和寻找疾病治疗的蛋白质靶点。CRISPR／Cas9系统只需要靶定一个20 nt的目的序列的gRNA，这个系统的目标设计、基因修改可以在1～2周内完成，在2～3周内可拿到克隆细胞系。CRISPR／Cas9可同时对同一个细胞的多个靶点进行编辑，使得多个基因的敲除、插入更为简单，效率更高。此外，CRISPR／Cas9还可切割线性DNA或超螺旋DNA。作为第三代基因编辑核酸酶，已经在疾病研究和临床治疗方面显示了重要的应用前景。现将几种基因编方法RNAi、Cre／LoxP、TALEN 和CRISPER／Cas9的特点总结于表13-1。
表13-1 不同基因编辑系统的比较(https://www.daowen.com)
上述内容介绍了常见的小鼠基因操作原理，在具体实验前还需要做很多知识准备。最关键的是掌握基本的分子生物学技术，掌握构建质粒、转染、鉴定等方法。同时，利用PCR技术扩增目的基因序列。得到所需要的DNA 序列后要进行DNA 和质粒的酶切操作，再利用T4 DNA连接酶进行目的质粒和插入DNA片段的连接。将连接体系进行大肠埃希菌转化，通过一定的筛选方法（如加入抗生素）进行阳性转化子的筛选和鉴定。最后将阳性转化子进行扩增，质粒的抽提，酶切鉴定，质粒测序鉴定。
质粒构建好之后，即可进行胚胎干细胞或动物囊胚的显微注射，该步需要专业技术人员进行，也可在国内研发类公司和研究单位购买到需要的转基因动物模型。构建好的动物模型一般要在无特定病原体的SPF环境中进行培养和繁殖。对繁殖的后代需提取DNA 再进行PCR实验，鉴定得到阳性的子代小鼠。通过研究阳性小鼠的表型变化获得某一基因序列的特定生理病理功能。
值得强调的是，任何技术都有两面性，基因编辑技术同样存在潜在的脱靶或错误编辑的可能性。随着技术的深入发展和工具库的扩充，以及科学家对基因编辑过程细节的研究，基因编辑技术必将展现出良好的临床应用前景。