流式检测细胞周期
1.原理 细胞周期是从细胞分裂产生的新细胞生长开始到下一次细胞分裂形成子细胞结束为止的过程，主要分为（G0）G1期、S期、G2期和M 期（图11-17A）。流式可以检测DNA含量，依据细胞DNA含量（图11-17B横坐标）来分析各周期。G1期：DNA复制未开始，DNA含量二倍体在流式结果图中显示为第一个峰。
图11-17 细胞周期示意图
S期：DNA开始复制到完成复制，是一个二倍体到四倍体的过程，在流式结果图中显示跨度特别大（第二个不高但很宽的峰）。
G2期：DNA复制完成至分裂的一段时间，此时细胞为四倍体，在流式结果图中的第三个峰。
M 期：细胞分裂过程，此时细胞也是四倍体，无法与G2期分开，故合称G2／M 期。
通常使用核酸染料来检测细胞周期（图11-18），常用的核酸染料有PI、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、7AAD、Hoechst等。
图11-18 用于细胞周期检测的核酸染料[PI（a），DAPI（b），7AAD（c），Hoechst（d，e）]
PI可通过破损的细胞膜与细胞内双链的DNA或RNA 结合，被488 nm 激光激发后发射红荧光，与核酸结合后其发射荧光信号的能力提高20～30倍。PI不能自由穿过活细胞完整的细胞膜，标记时需先用70%冰乙醇固定细胞，以RNase去除细胞内的RNA，加入0.2%的Trition X-100细胞膜通透剂，增加细胞膜通透性，使PI可以进入细胞内。
DAPI以非嵌入方式与DNA链上的A-T碱基对特异性结合。变异系数明显小于其他染料，是DNA定量染料，膜通透性很差，只有在高浓度时才能透膜。
7AAD 对DNA具有强亲合力，可嵌入双链DNA中，对富含GC的区域具有高亲合力，它不能透过细胞膜。
Hoechst常见为Hoechst33342和Hoechst33258，以非嵌入的方式与DNA 链上的A-T碱基对结合。这两种染料的激发和发射波长近乎相似，结构上略有不同，所带基团亲疏水性质不同，导致功能与应用上的不同。Hoechst33342能自由透过细胞膜进行活细胞染色，用于活细胞DNA定量分析，如精子分选，还用于侧群细胞的分选。Hoechst33258透膜性很差，有较强的水溶性，用于染色体分选。做细胞周期时，Hoechst33342不需要固定破膜直接染色上机检测，Hoechst33258与DAPI的方法一致，需要固定破膜，但不需要加RNase处理细胞，直接染色上机检测。
2.方法、流程和分析
（1）PI／7AAD标记法（图11-19）：这两种染料检测细胞周期需要固定破膜，也需要RNase处理细胞，步骤如下。
1）将需要分析的目标细胞制成单细胞悬液，取1×106个，300 g水平离心5 min。
2）先用300μl冷PBS重悬细胞，再逐滴缓慢加入700μl冰乙醇，4℃过夜；放-20℃可以保存2个月。
3）300 g水平离心5 min，弃上清液，1 ml冷PBS轻柔重悬。
4）300 g水平离心5 min，弃上清液，加入80μl 100μg／ml RNase A，37℃消化30 min。
5）加入320μl 50μg／ml PI染色液（含0.2%Triton X-100），轻轻混匀，避光2 min。(https://www.daowen.com)
6）上机检测，激发波长488 nm，发射波长610 nm 左右。
（2）DAPI／Hoechst33258标记法：这两种染料检测细胞周期优势是不需要RNase处理细胞。
1）将需要分析的目标细胞制成单细胞悬液，取1×106个，300 g水平离心5 min。
2）先用300μl冷PBS重悬细胞，再逐滴缓慢加入700μl冰乙醇，4℃固定过夜；放-20℃可以保存2个月。
3）300 g水平离心5 min，弃上清液。
4）加入500μl 50μg／ml DAPI／Hoechst33258染色液（含0.2%Triton X-100），轻轻混匀，避光2 min。
5）上机检测，激发波长355 nm，发射波长450 nm 左右。
（3）Hoechst33342标记法：这种染料的优势是不需要固定破膜，也不需要RNase处理细胞，步骤如下。
1）将目标细胞制成单细胞悬液，取1×106个，300 g水平离心5 min，弃上清液。
2）加入500μl终浓度5 mg／ml的Hoechst33342染色液，轻轻混匀，4℃避光染色40 min或过夜。
图11-19 碘化丙啶（PI）标记法检测细胞周期流式图
[BD C6流式细胞仪检测C3H10T1／2细胞。PI以FL2通道检测。FSC-SSC散点图圈定目的细胞群P1（a），FL2-A FL2-H 散点图中去除粘连体（b），FL2-A直方图显示PI阳性（即DNA含量）分布]
3）上机检测，激发波长355 nm，发射波长450 nm 左右。
除了流式细胞仪自带软件的分析之外，细胞周期的分析还可以使用专业的ModiFit软件，更加准确可靠。
3.实验注意点
（1）细胞周期实验前必须对细胞进行同步化，一般采用无血清培养饥饿12 h，再进行造模／药物处理。
（2）固定细胞时，要逐滴缓慢加入冰乙醇，不时拨动管壁，防止细胞聚团，固定不充分。
（3）收样用低速；图中坐标轴都用线性（Linear）形式，见图11-19。
（4）要做粘连体去除（图11-19B）：一般用FL2-A／FL2-H，也有用FL2-A／FL2-W。