荧光素偶联抗体及其标记方法
流式细胞仪接收到或强或弱的荧光信号来源于结合在样品细胞上的荧光素，荧光素被特定波长的激光激发后产生特定波长范围的荧光。
1.荧光素（fluorochrome） 在未被激发时外层电子处于基态，当被特定波长的激光激发后，外层电子接收到足够的能量就会跃迁到激发态，处于激发态的荧光素外层电子不稳定，会自发从激发态回到基态，同时释放出特定波长的荧光。荧光素被激发后发射的荧光被不同的荧光通道接收，它们之间的信号采集和分析不会相互干扰，从而使多荧光通道分析成为可能。目前有多种荧光素用于流式分析。它们被直接偶联或是间接标记于特定抗体上（作为二抗），使用该抗体标记细胞之后，上机检测细胞。不同激发光波长、常用的检测器及相应的荧光素见表11-2。
表11-2 不同激发光波长、常用的检测器及相应的荧光素
一般每个通道接收一个或几个常用荧光素发射的一定波长的光，习惯上以其常检测的荧光素作为该通道的名称，如“FITC通道”“APC通道”。
2.荧光素偶联抗体 由荧光素和抗体两部分组成。在标记样品细胞时，偶联抗体中的抗体与相应的抗原分子特异性结合，带有该抗原分子的细胞表面就结合有荧光素偶联抗体，其中的荧光被相应激光激发后发射特定波长的荧光信号，被相应的荧光通道接收，根据接收到的荧光信号强弱可判断该细胞群体表达相应抗原分子的情况。荧光素偶联抗体一般保存于4℃，少数按要求保存于-20℃。忌反复冻融，可以分装。
3.样品封闭 标记样品细胞的荧光素偶联抗体多为单克隆抗体，少数为多克隆抗体。其基本结构都包含有特异性结合抗原位点的Fab段和相对保守的Fc段，如图11-11A 所示。抗体的特异性表现在Fab段，标记时利用Fab段的抗原结合位点与细胞上抗原分子特异结合，如图11-11B所示。但有些细胞表面表达FcR（Fc receptor，Fc受体），如巨噬细胞、DC细胞、B淋巴细胞等，FcR可以与荧光素偶联抗体的Fc结合，如图11-11C。Fc与FcR的结合是相对非特异性的，与抗体种属和类别有关。一般同种属、同类抗体（如所有的鼠IgG 抗体）的Fc段相同，该种属细胞上的所有该类Fc段的FcR（如与鼠IgG对应的FcγR）都可以与Fc段发生非特异性的结合。
图11-11 抗体封闭原理示意图
Fab段与抗原结合和Fc段与FcR非特异性结合都使细胞带上荧光素，被激光激发后都产生荧光信号，造成假阳性。为消除这种非特异性结合、避免假阳性，可在用荧光素偶联抗体标记样品细胞之前先“封闭”样品。目前常用的荧光素偶联抗体基本都是IgG抗体，故可用无关IgG抗体先与样品细胞孵育一段时间，使样品细胞上的所有FcR都与无关IgG 抗体的Fc段非特异结合，然后再标记荧光素偶联抗体，这时样品细胞上的FcR都已饱和，无法与荧光素偶联抗体的Fc段结合，如图11-11D所示。事先封闭细胞上荧光素偶联抗体的非特异结合位点，以保证细胞与荧光素偶联抗体的结合都是特异性结合。
较严格的样品封闭主要有两种方法：①取与荧光素偶联抗体同种属来源的动物血清全IgG抗体与样品细胞充分混匀，4℃静置15 min。研究小鼠来源细胞时，若荧光素偶联抗体来源于大鼠，则封闭采用大鼠血清全IgG 抗体；研究人的细胞时，若荧光素偶联抗体来源于小鼠，则封闭采用小鼠血清全IgG抗体。②取适量的抗CD16（FcγRⅢ）和抗CD32（FcγRⅡ）单克隆抗体与样品细胞充分混匀，4℃静置15 min。CD16是一种FcR，能够与IgG 的Fc段结合，亲和力较强；CD32也是一种FcR，能够与IgG 的Fc段结合，亲和力中等。在标记荧光素偶联抗体前可以用抗CD16和抗CD32单克隆抗体封闭细胞，使样品细胞表面的FcR都被抗CD16和抗CD32单克隆抗体结合，从而阻止后续荧光素偶联抗体与FcR的非特异结合。(https://www.daowen.com)
4.荧光素偶联抗体标记 样品标记荧光素偶联抗体的方法比较简单。在样品单细胞悬液中加入适量的荧光素偶联抗体，充分混匀，于4℃避光30 min，离心洗去游离的抗体，PBS重悬细胞后就上样分析。一般孵育抗体的反应体系为100μl，取（2×105）～（1×106）个细胞／100μl体系。至于荧光素偶联抗体的用量，依据不同公司产品，在0.125～1μg抗体／100μl体系范围内不等。
流式抗体标记主要有：直接标记法和间接标记法2种方法，如图11-12所示。
（1）直接标记法：直接用荧光素偶联抗体标记样品细胞，抗体直接与样品细胞上的抗原分子结合，以与抗体直接偶联的荧光素作为指示剂，间接反映样品细胞表达相应抗原分子情况。只需一步标记，方法简单，非特异性染色少，是常用的标记方法，如图11-12a所示。
图11-12 流式抗体标记的直接标记法（a）和间接标记法（b）
（2）间接标记法：第一步用生物素（biotin）偶联抗体标记样品细胞，第二步用荧光素偶联链霉亲和素（streptavidin，SA）标记样品细胞，如图11-12b所示。采用的是生物素-亲和素系统，生物素与亲和素的结合在特异性、敏感性和结合力上均不弱于抗原-抗体之间的结合。间接标记法一般在多通道分析需要通道配搭以减少荧光素偶联抗体的种类时使用，可以在满足实验要求时节约实验成本。
5.荧光素的选择与流式多色配色 荧光素尽量选择可适用于所拥有的流式细胞仪且亮度高的，荧光素的分辨灵敏度以染色指数（stain index）判断（图11-13）。分辨灵敏度（从背景中分辨弱的阳性信号的能力）取决于阳性峰与背景峰间的宽度（D）和背景峰的宽度（W）。染色指数同时考虑这两个因素，是用D除以W。Stain Index=D／W。
图11-13 荧光素的染色指数（a）和常用荧光素的染色指数（b）
流式多色配色的原则：强荧光抗体尽量用于弱表达抗原的检测，而弱荧光抗体用于强表达抗原的检测。尤其是重要的标记抗原表达很弱时，一定要配强荧光的抗体，从而达到有效区分阳性细胞和阴性细胞的目的。并且在可选择范围内，尽量选择颜色补偿小的荧光素抗体配搭。但是以上是基本原则，具体还要结合抗体出厂QC的荧光强度来综合判断。