凋亡相关基因的蛋白质免疫印迹、RT PCR及分光光度法检测
1.蛋白质免疫印迹方法（以Caspase-3为例） Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中Caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原（32 kD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17 kD）和两个小亚基（12 kD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，Caspase-3的活性明显下降。分析Pro-caspase-3的活性，以及活化的Caspase-3对底物多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）等的裂解，用相应抗体检测活化Caspase-3和其底物PARP的表达量。
（1）操作步骤：
1）对于培养板（皿／瓶）中的细胞，弃除培养基。预冷PBS洗涤2次，加入RIPA 裂解液（具体配方见第九章）。加入裂解液体积以正好覆盖细胞层为佳，如6孔培养板：每个孔中加100μl，每个10 cm 培养皿加400μl。冰上孵育30 min后，收集细胞。
2）4℃，15 000 g，离心15 min，取上清液，上清液即为蛋白质样品。
3）之后可按照第九章介绍的蛋白质免疫印迹步骤进行实验。
（2）注意事项：除Caspase-3之外，Bcl-2，Bcl-xl，Bak，Bax，Cytochrome C，Caspase-8和Caspase-9等凋亡相关蛋白质的表达也可通过蛋白质免疫印迹实验检测。
2.RT-PCR方法（以Bcl-2／Bax为例） 可使用RT-PCR方法检测以上凋亡相关基因mRNA表达，作为参考。传统采用半定量RT-PCR（调内参，跑胶）方法，以Bcl-2和Bax灰度值相比进行分析。现在一般采用实时荧光定量PCR，以2-ΔΔCt方法分析（相关内容请参阅第八章“实时荧光定量PCR的原理和应用”）。以相应样品对应的Bcl-2与Bax的2-ΔΔCt值直接相比，即可得出Bcl-2／Bax的比值，再进行统计学分析即可。
3.分光光度计分析 活化的Caspase-3能够特异切割DEVD-X底物，水解D-X肽键。根据这一特点，设计出化学发光或荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-p NA（化学发光）或Ac-DEVD-AMC（荧光）。在共价偶联时，p NA 或AMC不能显色或者被激发荧光，短肽被水解后释放出p NA 或AMC，自由的p NA 或AMC 才能显色或被激发发射荧光。根据释放的p NA或AMC荧光强度的大小，可以测定Caspase-3的活性，从而反映Caspase-3被活化的程度。
（1）操作步骤（以p NA含量测定为例）(https://www.daowen.com)
1）配制0μM、10μM、20μM、50μM、100μM 和200μM 几个梯度的pNA，测定其在405 nm的吸光度，制定p NA标准曲线。
2）吸取细胞培养液，用胰酶消化贴壁细胞，并收集至备用的细胞培养液中。
3）100 g，4℃离心5 min收集细胞，小心吸除上清液，同时确保尽量没有细胞被吸除，PBS洗涤1次。
4）吸尽PBS后，按照每200万细胞加入200μl裂解液的比例加入裂解液，重悬细胞沉淀，冰浴裂解15 min。
5）4℃，13 000 g，离心10～15 min。
6）把上清液转移到冰浴预冷的离心管中。
7）立即测定Caspase-3的酶活性，将细胞裂解液加入Ac-DEVD-p NA（2 m M）后混匀，37℃孵育60～120 min（如果颜色变化不明显，可以适当延长孵育时间，甚至可以孵育过夜）。
8）样品的A405扣除空白对照的A405，即为样品中Caspase-3催化产生的p NA产生的吸光度。通过获得的p NA标准曲线的对比就可以计算出样品中催化产生了多少量的p NA。
（2）注意事项：底物DEVD-p NA需注意避光保存。