miRNA的提取和PCR检测

1.miRNA的提取 用于从细胞或组织中提取总RNA的试剂Trizol在miRNA的分离提取方面也比较有效。如果细胞或组织的起始量没有限制，常规的Trizol提取就已经足够，质量和重复性都比较好。如果样品有限或质量较差，则可以使用Ambion的miRVana miRNA isolation kit。

2.miRNA的实时定量PCR检测 由于成熟miRNA的长度仅为约22 nt，无法进行PCR扩增反应，故在进行该法检测之前，要对所提取的miRNA进行结构上的处理。一般的做法是在成熟miRNA的一端连接上一段已知序列的核苷酸，经逆转录后，再以此为模板进行后续的PCR扩增。目前常用的是茎环法和加尾法。

（1）茎环法：该方法是在miRNA成熟序列的3′端加上一段茎环序列，茎环尾部的6～7个碱基能够与miRNA的末端互补结合，为模板序列的合成提供羟基。在逆转录酶存在的情况下，以miRNA的成熟序列为模板进行逆转录，形成一段包含miRNA 及茎环结构的序列。这增加了miRNA的核苷酸序列，使PCR扩增成为可能。其优点在于可区分出存在单个碱基差异的同一miRNA家族的不同成员。

茎环法实时定量PCR 引物的设计需要注意：上游引物选择miRNA 成熟序列5′端的15～16个碱基，下游引物选择茎环序列的一部分。下游引物原则上要对应于待检测的目的miRNA单独设计，以保证高的扩增效率和特异性，但在上下游引物的Tm 值接近时，可以通用。另外，由于其茎环只针对特定的miRNA，故检测不同的miRNA 时要设计不同的茎环末端。(https://www.daowen.com)

（2）加尾法：该方法在定量PCR前，先在成熟miRNA的3′端加上一段多聚A尾，并用5′端带有40 nt锚定序列的Oigo（d T）引物进行逆转录，使得样品中所有的miRNA 均被延伸。加尾法较茎环法的应用范围更广，进行1次模板制备便可高通量检测不同miRNA 的表达情况，在对多个miRNA 的检测时较茎环法价格便宜，但加尾法对于同一个家族的miRNA区分能力较弱。加尾法的PCR引物设计需注意：上游引物与待检测miRNA 的成熟序列一致，下游引物与特异逆转录引物的一部分互补。以Clontech Mir-XTM miRNA First-Strand Synthesis Kit（638313）的试剂盒操作步骤为例：①按表8-7顺序配制以下逆转录反应体系；②轻弹混匀反应混合物，短暂离心后置于37℃孵育1 h，然后在85℃下孵育5 min，使酶失活；③加入90μl纯水，使总体积达到100μl。获得的cDNA 即可用于miRNA 的实时定量PCR检测；④miRNA内参引物采用该试剂盒中U6引物，Real time PCR步骤同SYBR Green法的PCR检测。

表8-7　逆转录反应体系