免疫酶细胞化学技术
1.酶标记抗体法（酶标法） 酶标记抗体技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，在光镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位。标记抗体常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。
酶标法与荧光标记抗体的染色方法大致相同，亦分为直接法和间接法，下面以HRP为例进行介绍。
（1）直接法：用HRP标记在一抗上，然后直接与组织细胞内相应的抗原结合，形成HRP标记的“抗原-抗体-HRP复合物”，与酶的底物作用产生有色物质。该法的优点是步骤少、简便省时、特异性高和非特异性染色较轻，缺点是敏感性较差（图10-3）。
图10-3 直接法示意图
（2）间接法：HRP标记的是二抗。反应时，先用未标记的一抗与组织细胞中相应抗原结合，然后用HRP标记的二抗与结合在抗原上的一抗反应，经DAB显色，间接地把组织细胞中的抗原显示出来。该法优点是只需HRP标记一种抗体（二抗），就可用于多种由同一动物制备的不同种类抗体（一抗），由于二抗的放大作用，故间接法比直接法敏感，但特异性不及直接法（图10-4）。
图10-4 间接法示意图
间接法的染色步骤：①石蜡切片脱蜡至水；冰冻切片用丙酮固定10～20 min，PBS缓冲液漂洗3次，各3 min。②0.3%H2 O2甲醇（30%H2 O2 1 ml加甲醇100 ml）处理切片15～30 min（室温），封闭内源性过氧化酶的活性。③根据需要可进行组织抗原的修复。④PBS漂洗3次，各3 min。⑤正常灭活兔／羊血清（1∶20）孵育15～20 min（以酶标抗体相同种属为宜，最好是同一动物免疫前的血清）。⑥弃去血清，不洗，滴加适当稀释的特异性一抗，湿盒4℃孵育过夜。⑦PBS充分冲洗3次，各3 min，去除切片上非特异吸附抗体。⑧滴加HRP酶标记的二抗，湿盒37℃内孵育45～60 min。⑨PBS漂洗3次，各3 min。⑩DAB／H2 O2显色，镜下控制显色时间。[11] 纯水充分洗涤，苏木精复染核，盐酸乙醇分化数秒。[12] 梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封固。
2.非标记抗体酶法 非标记抗体酶法是用免疫方法制备抗体，并且产生酶抗体的动物必须与制备待测抗原相应抗体的动物是同种族。当这种动物的免疫球蛋白作为抗原免疫另一种动物时得到的抗体，就能像桥梁一样与检测抗原的抗体和抗酶抗体连接在一起，酶再与抗酶抗体相结合，通过酶的显色达到对抗原的显示。(https://www.daowen.com)
（1）酶桥法：先用HRP制备成为一种高效价的抗酶抗体（第三抗体，抗HRP抗体），然后让这种抗HRP抗体与游离的HRP通过免疫反应而自然结合。在特异性一抗与抗酶抗体之间利用中间抗体（二抗）做“桥梁”，将它们连接起来，再将HRP结合在抗酶抗体上（图10-5）。
其基本流程是：抗原+抗体→+二抗（桥抗体）→+抗酶抗体→+HRP—DAB+H2 O2显色反应。该法中一抗、二抗、三抗都没有采用化学交联剂进行酶的标记，故又称为不标记法或非标记法。由于抗体未被标记物所标记，分子量相对较小，比标记了的抗体更容易穿透组织细胞，因此不仅避免了交联过程对酶和抗体活性的不良影响，而且由于使用了三抗，具有对抗原的二次放大作用，故它又比间接法敏感。
图10-5 酶桥法示意图
图10-6 PAP法示意图
（2）PAP法：该法是将抗酶抗体和酶预先制备成可溶性酶复合物，这种复合物用的酶是过氧化物酶，因此被称为过氧化物酶-抗过氧化物酶（peroxidase-antiperoxidase，PAP）复合物。PAP法将酶桥法的第三抗体（抗酶抗体）预先与HRP结合，形成可溶性HRP-抗HRP复合物，即PAP复合物（图10-6）。
操作步骤：①石蜡切片脱蜡至水。②0.3%H2 O2甲醇室温处理切片10～20 min。③PBS洗3次，每次3 min，适当进行抗原修复。④以PBS洗3次，各3 min。⑤用稀释的正常灭活兔／羊血清室温孵育15～20 min。⑥用适当稀释的一抗，37℃孵育1 h，或4℃孵育过夜。⑦PBS洗3次，各3 min。⑧用适当稀释的二抗，37℃孵育30 min。⑨PBS洗3次，各3 min。⑩用适当稀释的PAP复合物，37℃孵育1 h，PBS洗3 min，重复3次。[11] 以DAB-H2 O2底物显色5～12 min，然后充分洗涤。[12] 用苏木精复染核30 s，常规脱水、透明、封片。
（3）En Vision法：又称ELPS法（enhance labeled polymer system），抗原-抗体反应结合后，第二抗体上标记有多聚化合物（葡聚糖）酶复合物（En Vision复合物），与第一抗体结合，进而由酶作用底物进行显色定位。每一个分子的复合物中约含70个分子的HRP和10个分子的第二抗体，复合物中的HRP的绝对数量远高于其他复合物（如ABC），因此En Vision法敏感性显著高于其他方法。该法无非特异性染色，背景很干净（图10-7）。
图10-7 EnVision法示意图
操作步骤：①石蜡切片常规脱蜡至水，PBS洗3次，每次3 min。②用0.3% H2 O2-甲醇室温处理切片10～20 min。③PBS洗3次，每次3 min，适当进行抗原修复。④用适当稀释的一抗，37℃孵育1 h，或4℃孵育过夜。⑤PBS洗3次，各3 min。⑥En Vision复合物（即用型）孵育30 min，PBS洗3次，各3 min。⑦纯水充分洗涤，常规苏木精复染，封片。
（4）Ramos方法（rapid micro-wave one step method）：是海军军医大学长海医院病理科和上海中达医学应用研究所共同研究建立的一种快速免疫组化一步法。它利用微波热效应和化学效应，与DAKO公司Epos酶标记特异性抗体相结合，以加速其抗原抗体相结合反应为其特点。该法的特点是：它先将HRP标记在一个惰性的聚合物上，形成一个酶标记复合物，再用酶标复合物标记各种特异性抗体，最后形成HRP聚合物—特异性抗体复合物。该法敏感性高，特异性强，无背景染色。
操作步骤：①切片常规脱蜡至水。②微波抗原修复，PBS液（250 ml）内，微波炉中（功率350 W）辐射约120 s，温度在80℃以内，待冷却。③PBS洗涤，吸干多余水分。④每张切片加25μl酶标记抗体，置微波炉中辐射55 s±5 s，保留3～5 min。⑤PBS洗涤2次，各2 min。⑥DAB-H2 O2常规显色5～10 min，或置微波炉中（功率280 W）辐射40 s±5 s。⑦纯水充分洗涤，常规苏木精复染，封片。