（四）溶液配制

（四）溶液配制

1.细胞冻存（图5-8）

（1）提前配制冻存液。

（2）胰酶消化细胞后，用完全培养基中和，在200 g离心4～5 min，吸掉上清液后使用冻存液重悬细胞。一般情况下，10 cm 皿细胞长满后，可冻存2～3支，细胞浓度约为几百万／ml。

（3）将1 ml细胞悬液转移至单个冻存管中，在冻存管上注明“细胞名称，细胞代数，日期，姓名”。

（4）戴棉手套将冻存管放到冻存盒（确保冻存盒中有足量的100%异丙醇）里，然后将冻存盒转移到-80℃冰箱中过夜（至少4 h）。

（5）第二天将冻存管快速转移至约-190℃液氮罐中，长期保存。应戴棉手套操作，防止冻伤。

图5-8　细胞冻存操作过程

2.细胞复苏（图5-9）(https://www.daowen.com)

（1）在37℃水浴中预热完全培养基5 min。

（2）吸取5 ml预热好的完全培养基，加入到15 ml离心管中。

（3）从液氮中取出一支冻存细胞，并放置于37℃水浴中直至溶解到只剩下一小点冰块时拿出（1～2 min），用70%乙醇消毒冻存管外表面后拿到生物安全柜内。

（4）吸取已解冻的细胞悬液，转移至含有完全培养基的15 ml离心管中，再吸取1 ml完全培养基冲洗冻存管内残留的细胞，一并收集到15 ml离心管中，盖紧管盖后轻轻颠倒混匀2～3次。

（5）200 g离心3～5 min，吸弃上清液并用1～2 ml完全培养基重悬细胞沉淀，将细胞悬液转移至10 cm 皿中，加入完全培养基9 ml。

图5-9　细胞复苏操作过程

（6）放入37℃、5%CO2培养箱中，十字交叉摇匀后静置培养。

（7）待细胞长到80%～90%融合度时，就可以对细胞进行传代了。