（四）超滤法
超滤法是利用半透膜的微孔结构，在一定外界压力的推动下，实现对物质的选择性分离、回收的膜分离方法。
1.实验原理 主要取决于溶质和溶剂中悬浮物的大小或分子量，利用一种压力活性膜或超速离心，使溶剂中比膜孔大的物质由于分子筛作用被截留，而水分子和小的溶质颗粒透过薄膜的分离过程（图17-2）。
2.主要材料和设备 蛋白酶K，1×PBS，无菌离心管，注射器，中空纤维超滤膜；低温台式离心机，-80℃冰箱。
3.操作流程 以提取细胞培养上清液中的外泌体为例。
（1）收集20 ml细胞培养上清液，置于无菌离心管中。
（2）4℃，2 000 g离心10 min，取上清液。
（3）将上清液转移至另一无菌离心管，加入100μl蛋白酶K。
图17-2 超滤法原理示意图(https://www.daowen.com)
（4）颠倒混匀后，置37℃静置30～60 min。
（5）将上述样品装入含有200 nm 大孔径中空纤维超滤膜的20 ml注射器内。
（6）按压注射器活塞，使滤液流速控制在每秒2～3滴。
（7）将收集的滤液转移至含50 nm 大孔径中空纤维超滤膜的3 ml注射器内。
（8）轻轻按压注射器活塞，彻底排空残余液体。
（9）取出过滤器磁盘，磁盘上的微粒即为外泌体。
（10）用200μl 1×PBS重悬磁盘上的微粒，-80℃条件下可保存1年。
4.优缺点 样品预处理过程简单，省时，所需设备少。回收率较高，且不影响外泌体的生物学活性。但试剂成本高，回收的外泌体纯度不高，易变形或破碎。外泌体可能会阻塞过滤孔，导致膜的寿命减低，分离效率降低；外泌体膜之间可能发生相互黏附，导致分离量降低。
5.注意事项 建议使用0.22μm 滤器对待提取样本进行预处理，排除＞220 nm 的微泡。但无法去除150～220 nm 的滤泡，需进一步纯化。