SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel，PAG）上进行，所用条件需确保蛋白质解离成单个多肽亚基并尽可能减少其相互间的聚集。PAG的优点是兼有电泳支持体及分子筛的功能，且具有相对的化学稳定性，纯度高，溶解度小，无电离基团，受p H 和温度变化较小，并可通过改变交联度而调节孔径大小范围。
1.聚丙烯酰胺凝胶（PAG）的形成和结构 PAG是由丙烯酰胺（acrylamide，Acr）和交联剂N，N′-甲叉双丙烯酰胺（N，N′-methylenebisacrylamide，Bis）在有引发剂和增速剂的情况下聚合而成（图9-3）。Acr单体形成长链，由Bis的双功能基团和链末端的功能基团反应而发生交联。Acr在聚合过程中有Bis存在时，无序的多聚体链才能交联形成共价筛网（图9-4）。
图9-3 丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺化学结构式
图9-4 聚丙烯酰胺凝胶的三维网状结构
a.稀溶液；b.浓溶液；c.凝胶
Acr和Bis对中枢神经系统有毒，即使是1%的稀溶液与皮肤接触也会引起皮肤发炎，小鼠的半数致死剂量（LD50）为170 mg／kg。在操作时应尽可能避免直接接触和吸入微尘。Acr的聚合通常是由化学或光化学过程完成。常用过硫酸铵（ammonium persulfate，APS）或过硫酸钾、核黄素作为引发剂，用N，N，N′，N′-四甲基乙二胺（N，N，N′，N′-tetramethylethylenediamine，TEMED）作为增速剂。它可催化由APS产生的自由基的形成，加速PAG的聚合。APS为白色粉末或结晶，固体粉末可在室温保存，但在溶液状态时不稳定，需在4℃保存，最好新鲜配制。TEMED是易吸湿的无色液体，有浓烈的氨味。纯度至少应为99%，若暂时不用，最好密封保存于低温。
2.聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）电泳系统 PAGE系统分为两种。①连续系统：其缓冲液p H 及凝胶浓度相同；②不连续系统：凝胶分为两层不同孔径的系统，即堆积胶（stacking gel）或称浓缩胶（concentrating gel）、分离胶（separation gel）或称电泳胶（running gel）。两层凝胶中所用的缓冲液p H 不同。堆积胶中常用Acr浓度较小、孔径相对较大，缓冲液为p H 6.8左右的Tris-HCl；而分离胶常用Acr浓度较大、孔径相对较小，缓冲液为p H 8.8左右的Tris-HCl。分离胶层居下，堆积胶层居中，上面为样品层。虽然不连续电泳在缓冲系统的选择和制胶的操作方面比较繁杂，但由于不同孔径凝胶的分子筛作用，使不连续电泳的分辨率大大高于连续电泳。
3.不连续系统凝胶电泳的分离原理
（1）浓缩效应
1）凝胶层的不连续性：两层凝胶层中的原料总浓度及交联度不同，孔径大小不一。浓缩胶的孔径大，分离胶孔径小。带电荷的蛋白质离子在大孔径层中移动时，受到阻力小，移动速度大。当它接近小孔径的分离胶时，移动速度逐步减慢，使样品浓缩，形成一窄带。(https://www.daowen.com)
2）缓冲液离子成分的不连续性：大多数蛋白质pI在5.0左右，在p H 8.8或6.8时均带负电荷，在电场中均移向正极。电泳开始后，大孔径浓缩胶层内的Cl-（快离子）快速向阳极移动，蛋白质离子和甘氨酸离子（为电泳缓冲液中的成分，属慢离子）缓慢移动。由于Cl-后面胶层的离子浓度骤然降低，形成一个电位差区域，使蛋白质及甘氨酸离子加速向阳极移动，从而形成一个稳定的不断向前移动的界面。蛋白质离子聚集在Cl-和甘氨酸离子之间，浓缩成很窄的薄层。
在分离胶层中，因缓冲液p H 为8.8，甘氨酸进入分离胶层后，解离度大为增加，有效迁移率几乎与Cl-接近。而由于分离胶孔径小，蛋白质在移动时，所受阻力比较大，移动缓慢。所以，在分离胶层不具备浓缩效应而只有分离效应。
3）p H 的不连续性：堆积胶层与分离胶层之间的p H 有区别，在分离胶层中，由于p H 的原因，使样品离子的移动不再受快慢离子界面的影响，而只靠蛋白质的电荷大小及凝胶的分子筛作用达到彼此分离的目的。
（2）分子筛效应：凝胶电泳因凝胶浓度的不同，网的孔径大小也不同，可通过的蛋白质分子量范围也就不同。在分离胶层中孔径较小，分子量及构型不同的蛋白质分子，通过一定孔径的凝胶时所受阻力不同，泳动速度亦不相同。故多种蛋白质分子即使所带电荷相同、迁移率相等，在PAG中经一定时间泳动后，也能彼此分离。大分子受阻程度大，走在后面；小分子受阻程度小，走在前面。
（3）电荷效应：各种蛋白质因所带电荷不同，有效迁移率亦不同，负载电荷多的移动快，反之则慢。即使蛋白质混合物在堆积胶层和分离胶层交界处被浓缩成狭窄区带，当进入分离胶时，由于电泳体系已处于均一的连续状态中，故以电荷效应为主，带不同电荷的蛋白质离子以其移动速度的大小而达到顺次分离（图9-5）。
4.SDS-PAGE原理 利用凝胶电泳准确测定某一蛋白质或肽类的分子量，必须将电荷效应去掉或减少到最小，使被测物的泳动速率大小完全取决于分子量。在凝胶电泳系统中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠（sodiun dodecyl sulfate，SDS）称为SDS-PAGE。
图9-5 不连续电泳系统凝胶分离原理示意图
（1）SDS作用：SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶剂，能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏二级和三级结构。另外，强还原剂如β-巯基乙醇（βmercaptoethanol）和二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。当蛋白质样品中加入SDS和还原剂后，95～100℃煮约5 min，蛋白质分子解聚成多肽链。解聚后的氨基酸侧链与SDS 充分结合，形成带负电荷的蛋白质-SDS 胶束（protein-SDS micelles），所带负电荷大大超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子之间原有的电荷差异。蛋白质-SDS胶束在水溶液中的形状像一个长椭圆棒，其短轴基本相同，约为1.8 nm，长轴的长度则与亚基的分子量大小成正比。此时，不同泳动速率仅反映了各蛋白质亚基的分子量的差别。当分子量在15～200 k D时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系。
（2）SDS-PAGE配方：可根据目的蛋白分子量大小选择合适的凝胶浓度，表9-1供参考。
表9-1 SDS-PAGE堆积胶（4%）与不同浓度分离胶配方
