显色显影与凝胶图像分析

底物标记方式有生物素标记、地高辛标记、各种酶标记等。而酶标记的底物包括各种生色底物、化学发光法底物和荧光底物。由于酶促反应比同位素安全且快速，已成为蛋白质免疫印迹的主流检测方法。酶促反应配不同的底物实现不同的显色方法，如化学发光和底物显色。目前各厂家开发的化学发光法产品灵敏度已达到pg级别甚至fg级别，灵敏度超过了同位素。而底物显色法由于属直接显色，操作简便且成本低。最常用的底物是HRP和AP，还有比较少见的葡萄糖氧化酶（glucose oxidase）、β半乳糖苷酶（β-galactosidase）。

HRP是最常见的酶促发光或显色交联酶，由于比活高、特异性强、分子量小（40 kD）、稳定和作用底物范围广的优点而得到广泛使用。HRP的底物主要分为化学发光底物和生色底物，化学发光底物发光信号强、信号持续时间长、背景低、灵敏度高。化学发光法由于仅在酶和底物都存在时才会发光，故适合同一张膜对不同的目标蛋白分别进行多次检测。鲁米那（Luminol）是经典的化学发光底物，利用二抗上标记的HRP，使底物发生氧化还原反应，从而发出荧光。HRP的生色底物中，最常用的是二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB），在H2 O2存在下失去电子而呈现出颜色变化和积累，形成棕褐色不溶性产物，通过颜色变化积累过程检测蛋白质免疫印迹结果。显色后光照数小时会褪色，不能永久保存，需要拍照记录，而且有毒。(https://www.daowen.com)

与HRP相比，AP灵敏度更高、底物更稳定，也是常用交联酶之一。但AP实验常会遇到膜上显色背景偏高的问题，这是由于常用的封闭剂如脱脂奶粉和牛血清白蛋白中富含AP的原因。AP常用底物是5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐（5-bromo-4-chloro-3′-indolyphosphate ptoluidine salt，BCIP）、硝基四氮唑蓝（nitro-blue tetrazolium chloride，NBT）和硝基四紫唑（2-[4-Iodophenyl]-3-[4-nitrophenyl]-5-phenyl-tetrazolium chloride，INT）。BCIP／NBT是AP最佳的底物组合之一，产物为深蓝色。在AP催化下，BCIP被水解产生强反应性的产物，该产物与NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的沉淀。BCIP／INT组合在AP作用下，形成棕红色或橘黄色沉淀。

随着Cooled-CCD技术的发展，凝胶成像系统设备在科研实验室中使用越来越普遍。设备具有瞬时影像处理、立即输出、不需要胶片处理装置及暗室等成本花费、可用软件半定量分析等优点。Cooled-CCD技术应用于蛋白质免疫印迹化学发光法显影还要求底物能产生高强度、长持续时间的信号，以被照相机捕获到。经过不断开发，现在的化学发光检测试剂从以前的发光时间持续几十分钟，到现在多数试剂可持续长达几个小时到1天，很多兼容CCD成像检测。