（一）样品制备
流式细胞仪检测分析的对象是细胞（或细胞样颗粒性物质），需采用适当的方法制备单细胞悬液。样本（外周血，器官脏器）应新鲜采集。若取材条件不允许、样品又珍贵的情况下，需要液氮冻存保存样本，等收集所有样本之后一起复苏，短暂培养再标记检测。在这种情况下，务必统一细胞处理方式、冻存密度、冻存条件、复苏方式，并且对照组、模型组和各处理组条件一致，以尽量减少因处理带来的误差。另外，在样品细胞分离和洗涤过程中应尽量动作轻柔、低速离心，避免因动作粗暴、高速离心而致细胞损伤、细胞膜结构破坏。样品细胞染色一般取（2×105）～（1×106）个细胞／管，浓度2×106个／ml～1×107个／ml（取100μl）。
1.独立细胞样品的制备 独立细胞是指外周血、体外培养的原代细胞或细胞株（包括悬浮细胞和贴壁细胞）。
（1）体外培养的悬浮细胞：直接收集该悬浮细胞于离心管中，离心洗涤细胞，以流式PBS[无菌PBS中加入2%胎牛血清（FBS）]重悬细胞，用血细胞计数板或细胞计数仪计数，取≥2×105个细胞／管，与相应荧光素偶联抗体4℃避光孵育30 min，离心洗涤，重悬，上机检测。
（2）体外培养的贴壁细胞：需用含0.125%～0.25% 胰酶（Trypsin）溶液消化细胞适当时间后，终止消化，收集细胞于离心管中，接下来的步骤同上。
（3）外周血白细胞：采用红细胞裂解液裂解红细胞之后，离心去除红细胞碎片即可。
（4）外周血单个核细胞：分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），主要包括T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞，不包括中性粒细胞，最常用的方法是淋巴细胞分离液（Ficoll法，见图11-10）。Ficoll法可同时去除中性粒细胞和红细胞。以用外周血淋巴细胞分离液分离出大鼠PBMC为例，取大鼠动脉血以肝素钠（或EDTA-K2）抗凝，室温（15～25℃）保存，12 h内进行以下操作。
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图11-10 以淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞
以PBS等体积稀释外周血，取15 ml离心管在管底加入淋巴细胞分离液（与已稀释血液等体积），将已稀释血液加到等体积分离液液面上，使抗凝血∶PBS∶分离液=1∶1∶2。室温，800 g离心30 min。离心后，见离心管从上至下分别为血浆层（实验中显示黄色）、淋巴细胞层（实验中显示乳白色）、分离液层（实验中显示透明）和红细胞层（实验中显示红色）。小心吸取淋巴细胞层（PBMC）至15 ml管中。洗涤一次再进行离心（400 g，5 min），以适当培养基重悬细胞，计数，调浓度为106个／ml备用。
2.免疫器官样品的制备 中枢免疫器官是免疫细胞发育的场所，主要包括骨髓和胸腺；外周免疫器官是免疫细胞发挥功能的场所，主要包括脾脏和淋巴结。免疫器官主要由免疫细胞组成，细胞之间很少形成稳定的连接，免疫器官内结缔组织含量也较少。将免疫器官制备成单细胞悬液比其他实体脏器相对容易。
（1）骨髓单细胞悬液：以获取小鼠骨髓单细胞悬液为例，小鼠一般取长骨如股骨和胫骨内的骨髓。麻醉状态下颈椎脱臼处死小鼠，用剪刀、镊子直接分离出股骨和胫骨。以1 ml注射器在股骨或胫骨两端钻孔，然后用该注射器吸取培养基（或含2%FBS的PBS），反复冲洗股骨和胫骨的骨髓腔，直到发白为止。或者剔除干净股骨和胫骨，在研钵中加入3～5 ml含2%FBS的PBS，研磨至骨髓腔充分展开、发白为止。以1 ml移液器吸头反复轻柔吹打细胞液，使骨髓细胞尽可能分散，成为单细胞悬液。40μm 孔径的筛网过滤，离心去除上清液。以红细胞裂解液裂解红细胞，含2%FBS的PBS重悬细胞，调整浓度，取适量细胞，进行荧光素偶联抗体标记，然后上机检测。
（2）脾脏／胸腺／淋巴结单细胞悬液：以获取小鼠脾脏单细胞悬液为例。解剖小鼠取出脾脏后，准备10 cm 培养皿，放入孔径40μm 筛网，注入5 ml含2%FBS的PBS，以1 ml注射器推杆顶端的平面，轻轻研磨脾脏200次左右，弃结缔组织，离心去除上清液，以红细胞裂解液裂解红细胞，含2%FBS的PBS重悬细胞，调整浓度，取适量细胞，进行荧光素偶联抗体标记，然后上机检测。
3.实体脏器样品的制备 实体脏器如肝脏、肺脏、滑膜细胞和肿瘤组织内含有较多的结缔组织，细胞之间结合紧密，无法通过直接研磨得到理想的单细胞悬液。一般需要借助胶原酶（collagenase）与DNA酶（DNase）消化后，再进行研磨。
以小鼠滑膜细胞样品制备为例。解剖小鼠取出滑膜组织后，剪碎，加入Ⅰ型胶原酶（collagenase type1，Worthington）和100 U／ml的DNA 酶，或Accumax（Invitrogen）在37℃条件下消化1 h，再用研磨棒研磨，弃结缔组织，离心去上清液，红细胞裂解液裂解红细胞，离心去上清液，以含2%FBS的PBS重悬细胞，调整浓度，取适量细胞，进行荧光素偶联抗体标记，然后上机检测。