（一）样品准备

（1）称取肝组织样品100 mg放入离心管，再加RIPA 900μl（含广谱酶抑制剂，根据各生产厂家要求浓度进行配制）冰浴条件下匀浆破碎组织。立即加入其他特殊蛋白酶抑制剂，如100μl 10 m M PMSF液（终浓度约为1 m M），再将其转移到1.5 ml离心管中。

（2）4℃，15 000 g，离心15 min。取上清液，分装低温或超低温保存待用。

（3）另取上清液检测蛋白质含量及计算上样量。

1）测样品浓度：对样品进行蛋白质浓度测定。将样品稀释至合适的倍数，使稀释后的浓度在标准曲线范围内。如稀释25倍：2μl样品+48μl稀释液如PBS。按照试剂盒说明书要求操作，使样品中蛋白质与显色剂反应显色，在一定波长条件下测吸光度值。(https://www.daowen.com)

2）计算上样量体积：在分析软件中得出样品的实际蛋白质含量。求得在电泳前上样总体积（如25μl）中的样品体积，需保证上样的每个样品的浓度一致（如25μl上样体积中样品的蛋白质含量统一为10μg）。

（4）样品变性处理：根据计算得到的上样量体积，取上样量并加上样缓冲液（loading buffer，LB）。LB中含有指示剂溴酚蓝，由于分子量较小，电泳时处于最前方，可显示电泳进程；又含有甘油，可加大样品密度，使样品沉降到电泳孔中；含有的SDS则终止酶促反应，防止提取的蛋白质降解。如5×LB，则加总体积（25μl）的1／5体积（5μl），最后用RIPA或PBS补齐至总体积相等（25μl），混匀后95℃（热水浴或金属浴）煮5 min。所用的标记蛋白（marker）如果是非预染的，也需进行变性；如果用预染Marker，则不需要此步变性处理。

如检测得出稀释25倍后的样品蛋白质浓度是0.08 mg／ml，则样品稀释前浓度为2 mg／ml，即2μg／μl。经计算，得到含蛋白质10μg样品需上样的体积为5μl。另需加5×LB 5μl，以PBS 15μl补齐至总体积25μl。