高效液相色谱仪的使用方法
本部分仪器使用介绍以常见的Agilent 1260 HPLC色谱仪为例。
1.使用准备
（1）供试品溶液制备：按照确定的方法，把供试品提取制备成溶液，并过微孔滤膜（或高速离心取上清液）。
（2）流动相配制、过滤，并超声15 min以去除溶解的空气（混合流动相需超声更长时间）。
图19-3 Agilent 1260 HPLC色谱仪
图19-4 HPLC色谱仪构造示意图
（3）更换为新配制的流动相，从上向下依次打开各个模块电源。按照流动相流动方向接好色谱柱。打开电脑电源，打开化学工作站。
2.方法编辑 新建方法，设置进样体积、泵参数（包括流速、停止时间、后运行时间、溶剂A-B比例、时间表和溶剂体积）、柱温和检测波长。
3.序列编辑
（1）新建序列，进行序列表编辑（包括样品名称、方法选择、各样品进样次数和进样体积等），命名并保存编辑好的序列。
（2）序列参数编辑，包括数据文件保存路径设置、等待时间设置和后序列命令选择。(https://www.daowen.com)
4.清洗并排气泡（Purge） 先逆时针方向拧松Purge阀，100%水相以5 ml／min冲洗管道10 min，再用100%有机相以相同流速冲洗10 min，之后将流速调为0。此步骤可对六通阀之前的管道进行清洗和气泡的排除，并快速将管道内流动相替换为新配制的流动相。
注意：进行该操作务必先拧松Purge阀再调高流速，以防色谱柱损坏。
5.平衡 顺时针方向拧紧Purge阀，设置流动相比例，缓慢增加流速至1 ml／min并平衡至少60 min。
注意：观察并记录压力值、波动范围和信号基线是否平稳，压力值变化可能反映仪器工作状况。一般在甲醇-水二元流动相系统中，甲醇∶水=1∶1时，管道系统压力最大；在乙腈-水二元流动相系统中，乙腈∶水=1∶3时，管道系统压力最大。纯甲醇的压力60 bar左右，纯乙腈的压力40 bar左右。
6.测定 点击“开始”，进行样品分析。
7.冲洗色谱柱
（1）纯水和甲醇过滤、除气泡。更换流动相，并Purge。
（2）调用Wash方法。Wash方法设置：点击单瓶运行（吸取位置不填内容，注射器显示blank）；检测波长设置面板选择允许关闭进样；在菜单栏“方法”下点击运行时选项，勾上第一框填入lampall off，最后一框填入pumpall off；洗脱梯度表设置流速为0，设置梯度为：0～30 min，10%甲醇；30～60 min，10%→100%甲醇；60～90 min，100%甲醇。
（3）点击“开始”，进行色谱柱冲洗。
（4）关闭工作站，关闭各个模块电源，关闭电脑电源。
8.常见的问题
（1）漏液：一般发现压力与平时实验中记录的压力相差较大，甚至某些模块显示红灯时，首先考虑是否漏液。暂停仪器，关闭各个模块，依次检查漏液部位。用吸水纸轻轻吸干漏出的液体。
（2）新色谱柱的使用：在第一次使用前要进行活化处理。可咨询厂商。