（三）对照的设置

荧光素不仅能够在激光的激发下产生荧光，而且在细胞表面的某些分子或结构也能够产生荧光，这种荧光相对于荧光素产生的荧光较弱，并与细胞表面的特异抗原分子没有相关性，被称为非特异性荧光。每一种细胞都会产生非特异性荧光，流式检测得到的荧光信号是细胞本身的非特异性荧光和来自细胞结合荧光素的特异性荧光叠加得到的结果。设立阴性对照就是为了排除细胞的非特异性荧光对结果的影响。

1.阴性对照 每次流式实验必须设置阴性对照，一般一次实验设置一种阴性对照即可。图11-14是三类阴性对照和标记荧光素偶联抗体（抗CD44-PE）得到的荧光信号示意图。相比于三类阴性对照，可得出这群细胞有45%表达CD44分子。这里的三类阴性对照：①空白：细胞不加任何抗体，即通常说的blank管，所检测到的荧光信号与荧光素和细胞抗原无关，是非特异性荧光信号（背景）。这是最常用的阴性对照，在实验要求不高、能够确定同型对照的荧光信号与不加同型对照的这种阴性对照结果一致时，就可以采用这种阴性对照。②抗CD44：细胞加不带荧光素的抗体。检测到的荧光信号与荧光素无关，可能是细胞背景荧光，也可能是抗体带来的某种影响。这种对照用于排除抗体自身的影响，使用较少。③IgG1-PE：细胞加同型对照抗体，即加入与抗CD44-PE同种属、同亚型、同标记、同质量的非特异性抗体（未免疫的血清分离出来的）。这种同型对照抗体不能与细胞表面的CD44分子发生特异性结合，但可能发生非特异性的结合（如Fc段与细胞表面FcR的非特异结合等）。这种对照可以排除非特异结合的影响，是比较规范和精确的阴性对照。

图11-14　阴性对照示意图(https://www.daowen.com)

在同型对照基础上得出的流式结果才是最可靠的。购买的荧光素偶联抗体说明书上会列出该抗体的同型对照抗体，同型对照抗体需要根据这个信息单独去购买，建议使用与荧光素偶联抗体同一个公司生产的同型对照抗体。

2.荧光减一对照（fluorescence-minus-one control） 又称FMO 对照，是一种特殊的阴性对照，是指在多色（通道）分析时对其中某一通道特别设置的阴性对照。具体来说，是在多通道荧光素偶联抗体染色中，故意不添加其中一种荧光素偶联抗体（或只加其同型对照抗体），以显示并扣除其他的荧光素偶联抗体染色对它的影响的一种对照。

3.阳性对照 是用现有的荧光素偶联抗体和标记方法检测已知的阳性样本，以确定抗体，标记方法和过程是否可用可行。阳性对照不是每次流式实验必须，一般在遇到以下情况时考虑设置：①使用以前没有用过的荧光素偶联抗体时；②换用不同公司或同一公司不同批号的荧光素偶联抗体时；③使用储存时间较长的荧光素偶联抗体时。

设置阳性对照一般有两种方法：①用肯定表达相应抗原分子的样品细胞来检测。如检测某荧光素偶联的抗小鼠CD4抗体是否有效，可用抗体标记正常小鼠脾脏细胞，因为该样品细胞内肯定含有CD4阳性细胞，且已知CD4阳性细胞在脾脏细胞中的大致比例范围。所以，用该抗体标记脾脏细胞得到预料中的结果时，就可以认为该抗体有效。②使用实验室已证明有效的、与待测荧光素偶联抗体相同但偶联的荧光素不同的抗体，一同标记细胞。如需检测FITC偶联的抗小鼠CD4抗体（抗CD4-FITC）是否有效，实验室已有证明有效的PE偶联的抗小鼠CD4抗体（抗CD4-PE），这时可以用两种抗体同时标记同一份有CD4抗原分子表达的细胞。流式检测后，FITC阳性的细胞群，PE也是阳性；FITC阴性的细胞群，PE也是阴性，就可证明该荧光素偶联抗体有效。