色谱条件的优化和确定

色谱柱：C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流速：1.0 ml／min；检测波长：190～400 nm中选取适当的波长（最佳波长可用DAD检测器确定）；进样量：10μl；柱温：30℃；流动相：水溶液（A）-甲醇或乙腈（B），可按照药典及文献中记载的比例或梯度进行试验。(https://www.daowen.com)

若无文献记载或待分析的样品成分复杂，可先用梯度洗脱，0～5 min：5%乙腈；5～65 min：5%→95%甲醇；65～75 min：95%甲醇。该法得到的供试品色谱图和对照品色谱图可进行比较，确定待测成分保留时间和对应的有机相比例，后续慢慢调整梯度变化（或等度洗脱的流动相比例），如某个区段色谱峰较集中，则可以通过减缓有机相比例增加的速度来实现更好的分离。最终调整好后的方法可用DAD检测器进行峰纯度测定，或可以分别进样供试品溶液和阴性溶液以确定该成分的测定不受干扰。