（六）排阻色谱法
排阻色谱法是一种根据试样分子的尺寸进行分离的色谱技术。又称为凝胶色谱法、分子排阻色谱法、尺寸排阻色谱法等，是液相色谱的一种。
图17-3 排阻色谱法原理简易示意图
1.实验原理 色谱柱以凝胶为填料，凝胶含有许多尺寸不同的孔穴或立体网状物质，其孔穴大小与被分离试样大小相当，仅允许直径小于孔穴的组分通过。将试样加入色谱柱后，样品中的大分子不能进入凝胶孔穴，只能沿凝胶间的空隙通过色谱柱，最先被洗脱下来；中等大小的组分可以部分进入凝胶孔穴中，在色谱柱中滞留，较慢地从柱中洗脱下来；小分子组分可进入凝胶中地大部分孔穴，受到的滞留作用最强，更慢地被洗脱下来。而样品中溶剂分子量最小，可进入凝胶的全部孔穴，最后流出，以此实现大小不同组分的完全分离。由于外泌体粒径较蛋白质和脂类物质大，能快速通过色谱柱，从而与其他杂质分离（图17-3）。
2.主要材料和设备 1×PBS，无菌离心管，包含2%琼脂糖的凝胶色谱柱；纳米颗粒分析仪，分光光度仪，低温台式离心机。
3.操作流程 以提取血清中的外泌体为例。
（1）吸取1 ml血清，置于无菌离心管中。
（2）4℃，1 500 g离心20 min，取上清液置于新的无菌离心管。
（3）4℃，3 000 g离心15 min，取上清液置于新的无菌离心管。
（4）4℃，3 000 g离心20 min，取550μl血清置于新的无菌离心管，待用。(https://www.daowen.com)
（5）旋开凝胶色谱柱的出口，用1×PBS冲洗。
（6）将上述已处理好的血清样品加入凝胶色谱柱中。
（7）旋开凝胶色谱柱的出口，收集500μl的馏分。
（8）分别使用纳米颗粒分析仪和分光光度仪对馏分中的外泌体和蛋白质进行测定。
（9）包含外泌体的馏分可进行后续分析、测定。
4.优缺点 操作简单、方便，重现性好，获得的外泌体纯度高，富集效率好。不受剪切力的影响，能保证外泌体的完整性和生物活性。由于未添加其他化学试剂，对后续研究几乎无影响。但对上样量要求较高，一般要求控制在500μl以内，否则会降低分离效率。样品中蛋白质和脂类等组分会对凝胶色谱柱造成严重的污染，使其无法多次重复使用，使用寿命降低。
5.注意事项
（1）适用于分离分子大小相差较大的组分，对分子大小相近组分的分离效果不太理想。
（2）分离效能主要取决于柱高、加样量、凝胶孔径大小及凝胶质量等因素。
（3）收集多个含外泌体的馏分可提高回收效率，但会降低外泌体的纯度。