PCR反应体系与反应条件
1.PCR反应体系 PCR反应体系中必备的要素有5种，即模板、引物、DNA 聚合酶、d NTP和Mg2+（表8-1）。
表8-1 PCR反应五要素__
（1）模板：核酸的量与纯化程度是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA 纯化方法通常采用十二烷基硫酸钠（SDS）和蛋白酶K 来消化处理标本。一般检测标本，可采用快速简便的方法（如强碱裂解），溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA 模板提取一般采用Trizol法，详见PCR反应模板制备部分。
（2）引物：引物与模板特异、正确结合是PCR反应特异性的决定因素。引物设计的总原则就是保证扩增的效率和特异性，需考虑引物与模板结合的特异性和效率，以及DNA 聚合酶从引物起始和之后的延伸效率（表8-2）。
表8-2 PCR引物设计注意点
关于引物的用量：每条引物的浓度0.1～0.5μmol／L，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。关于引物的设计软件有Oligo 7、DNAstar、Primer Premier 6.0、Primer Express3.0 等，在线软件有Primer3：http：／／bioinfo.ut.ee／primer3／，Primer-BLAST：http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／tools／primer-blast／。关于引物的特异性检测推荐在NCBI数据库中以primer-BLAST软件检测。
（3）热稳定的DNA聚合酶：目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从水生嗜热杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化典型的PCR反应约需酶量0.5 U（指总反应体积为20μl时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。近年来发明的热启动Taq酶，是用化学修饰或抗体修饰把酶的催化位点封闭起来，让酶在常温下失去活性，这样大大减少了加样过程中导致的非特异扩增。加热以后会导致化学修饰或抗体失活，使Taq酶重新恢复活性。
（4）d NTP：质量与浓度在一定范围内会影响到PCR的扩增效率。dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，配制时宜把p H 调成碱性，这在一定程度上可防止原液在冻融时损坏d NTP的分子结构。一般配制成高浓度原液（如100 mmol／L），以NaOH 将其p H 调节到8.1，小量分装，-20℃冰冻保存，避免多次冻融。在PCR 反应中，d NTP应为50～200μmol／L。高浓度d NTP（＞4 mmol／L）对扩增反应起抑制作用（与Mg2+螯合），浓度过低会降低PCR产物的产量。尤其是注意4种d NTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其他几种时（偏高或偏低），就会引起错配。
（5）Mg2+：是Taq DNA聚合酶的激活剂，显著影响其酶活性和PCR扩增的产量及特异性。Mg2+可以与负离子基团（如磷酸根）结合，在PCR中，DNA模板、引物和d NTP是磷酸根的主要来源。因此反应系统中，Mg2+的最适浓度还要受到d NTP浓度的影响，欲获得最佳反应结果，要对反应条件进行必要的探索。每当一个新的目的片段和引物第一次使用时，或某种参数（dNTP或引物浓度）改变时，应进行Mg2+的最适浓度滴定。原则是样品中Mg2+的最终浓度至少要比d NTP总浓度高0.5～1.0 mmol／L。在一般的PCR反应中，各种d NTP浓度为200μmol／L时，Mg2+浓度为1.5～2.0 mmol／L为宜。随着Mg2+浓度升高，反应特异性降低，出现非特异扩增。Mg2+浓度过高（如＞8 mmol／L）或浓度过低（如＜0.8 mmol／L），都会抑制Taq酶的活性，使扩增效率降低、反应产物减少。(https://www.daowen.com)
为简化流程、减少配制体系出错概率，目前很多商品化的PCR试剂盒已经预先把d NTP和Mg2+（也包括Taq酶）按一定比例混合成Mix，是经过预实验优化配比可直接使用的。如果扩增仍有困难的，建议在一定范围内，结合d NTP和引物浓度，通过预实验摸索最佳Mg2+浓度。
2.PCR反应条件的选择
（1）温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸3个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因（长度为70～300 bp时）可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94～95℃变性，60～65℃左右退火与延伸（此温度下Taq酶仍有较高的催化活性）。
1）变性温度与时间：变性温度低，解链不完全会导致PCR失败。一般情况下，94～95℃1 min足以使模板DNA变性，若低于94℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。
2）退火温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的重要因素。变性后温度快速冷却至40～60℃，可使引物和模板发生结合。退火温度和时间取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶序列的长度。对于20个核苷酸、G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的退火温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
Tm 值（解链温度）=4（G+C）+2（A+T）
退火温度=Tm 值-（2-10℃）
在Tm 值允许范围内，选择较高的退火温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。退火时间一般为15～60 s，足以使引物与模板之间完全结合。
3）延伸温度与时间：PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃，常用温度为72℃，过高或过低的延伸温度会影响Taq酶活性。PCR延伸反应的时间可根据待扩增片段的长度而定，一般1 kb以内的DNA片段，延伸时间1 min是足够的。3～4 kb的靶序列需3～4 min；扩增10 kb需延伸至15 min。延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现，对低浓度模板的扩增，则延伸时间要稍长些。
（2）循环次数：决定PCR 扩增产物的量。鉴于平台期的到来，循环次数多选在30～40次，一般情况下可获得相当可观的产物量。