（五）质粒的鉴定

一般来说，抽提到的质粒可能包含有目的DNA片段，也可能不包含目的DNA 片段，也有可能包含的目的片段在连接、转化、凝胶电泳及割胶回收等试验过程中出现了序列突变等情况，这时就需要对重组质粒进行鉴定分析，才能确保抽提到的质粒是序列正确无误的重组质粒。常规的鉴定包括下面的3种方法。

1.菌落PCR 鉴定 用无菌枪头将单个菌落挑至50～100μl LB液体培养基中混匀，吸取1μl作为PCR模板。使用一条通用质粒测序引物或设计一条目的基因序列特异性引物进行菌落PCR扩增，用空载体和水作为阴性对照。如果能扩增出大小正确的目的DNA 片段，则说明目的DNA序列和质粒连接成功。将连接成功的菌液进行摇菌大量扩增，抽提质粒后送到公司进行测序分析，即可知道目的基因序列是不是完全正确，是否在操作过程中有突变存在。选出完全正确的质粒进行基因转染、病毒包装等下游实验。(https://www.daowen.com)

2.酶切鉴定 如果通过双酶切位点能将目的基因序列成功连接到某一载体上，那么可通过同一双酶切反应（也可选择其他酶切位点进行操作）将连接上的目的基因序列从重组质粒上切割下来。如果切割下的序列在琼脂糖凝胶电泳图中的大小位置正确，那就表明抽提到的重组质粒包含有目的基因序列。将对应的重组质粒送到公司进行测序分析，即可知道目的基因序列是否完全正确，是否在操作过程中有突变存在。选出完全正确的质粒进行基因转染、病毒包装等下游实验。

3.DNA测序鉴定 菌落PCR 鉴定和酶切鉴定只能表明重组质粒中包含目的基因序列，并不能保证目的基因序列完全正确，因为在连接、转化、凝胶电泳及割胶回收等实验操作过程中会发生序列突变等情况。质粒鉴定中最可靠的鉴定方法是测序鉴定。这时就需要将抽提到的质粒送到公司进行测序分析，可以使用特定质粒的通用引物或自己设计一段引物进行测序。测序结果出来后通过比对分析即可知道目的基因序列是否完全正确，是否在操作过程中有突变存在。选出完全正确的质粒进行基因转染、病毒包装等下游实验。