（三）比色法

1.双缩脲法 具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应（Biuret reaction）。蛋白质和多肽分子中的肽键在碱性溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，在540 nm 处有最大吸收，称为双缩脲反应。在一定浓度的范围内，双缩脲反应所呈的颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关。因此可用比色法定量测定，通过绘制标准曲线得出蛋白质含量。双缩脲法线性测定蛋白质范围为1～10 mg，其操作简单，线性关系好，常用于需要快速但不要求十分精确的测定，但灵敏度差，测量范围较窄。

2.Folin-酚试剂法（Lowry法） 蛋白质（或多肽）分子中含有酪氨酸或色氨酸，能与Folin-酚试剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物。蓝色深浅与蛋白质浓度成正比，可测定蛋白质浓度。这种测定方法灵敏，但试剂配制较为困难。该法的显色原理与双缩脲方法相同，只是加入了第二种试剂，即Folin-酚试剂，以增加显色量，从而提高检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深蓝色的原因是：①在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。②Folin-酚试剂中的磷钼酸盐-磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色。该法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。最低蛋白质可检测的量达5μg，通常测定范围是20～250μg。因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间。

3.考马斯亮蓝法

（1）实验原理：1976年由Bradford建立的考马斯亮蓝法（Bradford法）是利用蛋白质-染料结合的原理，定量测定微量蛋白质浓度的方法，是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。该方法原理是：考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置由465 nm 变为595 nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色，通过测定595 nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。染料主要与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。通过测定已知不同浓度的蛋白质吸光值的大小，制作标准曲线后，将待测样品吸光值代入公式，即可求出未知蛋白质样品的浓度，实现了蛋白质浓度测定的快速、稳定和高灵敏度。(https://www.daowen.com)

（2）Bradford法的优点：①灵敏度高，其最低蛋白质检测量为0.5μg。因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大得多。②蛋白质和考马斯亮蓝结合，在2～5 min达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1 h内保持稳定。③干扰物质少，如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+和Tris缓冲液、糖与蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰该测定法。

4.二辛可宁酸法（BCA法）

（1）实验原理：二辛可宁酸（BCA）是一种稳定的水溶性复合物，与含Cu2+的硫酸铜等其他试剂混合一起变为苹果绿色，即为BCA工作试剂。在碱性条件下，Cu2+被蛋白质还原成Cu+，Cu+和BCA相互作用，两分子的BCA螯合一个Cu+，形成紫色的络合物。工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合物。该复合物为水溶性，在562 nm 处显示强吸光性。测定其在562 nm处的吸光值，在一定浓度范围内，吸光度与蛋白质含量呈良好的线性关系。通过制作标准曲线，即可计算待测蛋白质的浓度。该法灵敏度高，检测浓度下限达到25μg／ml，最小检测蛋白质的量达到0.5μg，待测样品体积为1～20μl。

（2）BCA法的优点：①准确灵敏，检测范围大，在50～2 000μg／ml浓度范围内有较好的线性关系。②测定快速简便，37℃孵育30 min后即可检测。③干扰物质少，BCA 法不受大部分样品中的离子型和非离子型去垢剂等化学物质影响，可兼容样品中高达5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20、60、80。