实时定量PCR中的荧光化学物质

根据所使用的荧光化学物质不同分为荧光染料法和荧光探针法两类。荧光染料法是最早使用的一种扩增序列非特异性的检测方法，荧光探针法是基于荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）的原理建立。当一个供体荧光分子的荧光光谱与另一个受体荧光分子的激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自身荧光程度衰减，这种现象称为FRET。

1.荧光染料 DNA结合染料与DNA 双链结合时，在激发光源的照射下发出荧光信号，其信号强度代表双链DNA分子的数量。随PCR产物的增加，PCR产物与染料的结合量也增大。不掺入链中的染料不会被激发出任何荧光信号。目前广泛使用的染料是SYBR GreenⅠ，可特异结合于DNA 双链的小沟中。游离的SYBR GreenⅠ几乎没有荧光信号，但结合DNA后，它的荧光信号成百倍增加。因此PCR扩增产物越多，SYBR GreenⅠ结合得越多，荧光信号也就越强。

荧光染料的优点是适用于任何DNA，没有序列特异性，可用于所有模板扩增；不必设计复杂探针，使用方便，成本低；有较高的灵敏度。缺点是也能与非特异性双链DNA 结合，产生假阳性。必须进行熔解曲线分析。

熔解曲线（dissociation curve）是指随温度升高DNA 的双螺旋结构降解程度的曲线。使用SYBR GreenⅠ作为荧光基团时，随着PCR反应的进行，双链PCR产物呈指数增长，SYBR GreenⅠ与双链PCR产物结合后荧光越来越强。当PCR反应结束时，荧光强度达到最大，此时缓慢升温，从60℃（或65℃）一直加热到95℃，在此过程中PCR产物随升温双链被缓慢打开，荧光强度也随着双链的打开依次减弱。升至一定温度，在一个狭窄的温度区间内，双链迅速打开，荧光急剧减弱（图8-6a）。如果以荧光信号改变的负的一次导数与温度作图，会得出一个单峰图（图8-6b）。PCR产物双链打开50%时对应的温度值，称为该产物的Tm 值，对应于单峰图的峰顶处温度值。其峰值与扩增片段长短有关，与模板浓度无关。扩增的每个基因都有其相对应的熔解曲线，一般目的基因峰值在80～90℃，出现其他峰就可能为引物二聚体（一般为60～75℃）或其他非目的产物，基因组DNA 污染的峰值会在90℃以后。设计跨外显子引物可避免基因组DNA 扩增。需要注意的是，熔解曲线单峰，只代表产物单一，要结合Primer-BLAST分析才能做出特异性判断。

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图8-6　熔解曲线：相对荧光单位与温度作图（a），用相对荧光单位的负导数与温度作图（b）

（图片来自BioRad CFX96）

2.荧光探针 荧光探针可分为水解探针、分子信标等。水解探针以TaqMan探针为代表，TaqMan技术原理是利用Taq酶的5′-3′核酸外切酶活性，裂解双链DNA5′端的核苷酸，释放出单个寡核苷酸。基于Taq酶的这种特性，依据目的基因设计合成能够与之特异性杂交的探针，该探针的5′端标记报告基团（荧光基团），3′端标记淬灭基团。正常情况下两个基团的空间距离很近，构成了FRET关系，荧光基团因淬灭而不能发出荧光。PCR扩增时，引物与特异性探针同时结合到模板上，探针结合的位置位于上下游引物之间。当扩增延伸到探针结合的位置时，Taq酶利用5′-3′外切酶活性，将探针5′端连接的荧光分子从探针上切割下来，破坏了两个荧光分子间的FRET，从而发出荧光，切割的荧光分子数与PCR 产物的数量成正比。因此根据PCR反应体系中的荧光强度即可计算出初始DNA模板的数量（图8-7）。

图8-7　TaqMan的基本原理示意图