TUNEL检测
细胞凋亡中，染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的黏性3′-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（Td T）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA 的3′-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL）（图15-2）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA 的断裂，因而没有3′-OH 形成，细胞很少能够被染色。TUNEL法可对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反映细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻切片、培养的细胞和从组织中分离细胞的细胞凋亡测定。
1.实验步骤（以生物素标记检测为例）
（1）标本预处理
1）石蜡切片预处理：切片脱蜡至水，PBS洗5 min，加入蛋白酶K 溶液室温15 min，纯水洗4次，每次2 min，然后按下述步骤进行。
图15-2 TUNEL法检测细胞凋亡
2）冰冻切片预处理：4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗2次，每次5 min，置乙醇：乙酸（2∶1）溶液中，于-20℃处理5 min，PBS洗2次，每次5 min，然后按下述步骤进行。
3）培养的细胞预处理：PBS洗涤细胞1次，4%多聚甲醛固定细胞30 min。用PBS洗涤1次，加入含0.3%Triton X-100的PBS，室温孵育5 min，然后按下述步骤进行。(https://www.daowen.com)
（2）PBS配制的0.3% H2 O2溶液中室温孵育20 min，以灭活内源的过氧化物酶，随后用PBS洗涤3次。
（3）配制生物素标记液（试剂盒中都有），在样品上加50μl生物素标记液，37℃避光孵育60 min。
（4）用PBS洗涤1次，滴加0.1～0.3 ml标记反应终止液，室温孵育10 min。
（5）用PBS洗涤3次，配制Streptavidin-HRP工作液和DAB显色液。
（6）在样品上加50μl Streptavidin-HRP工作液，室温孵育30 min。
（7）用PBS洗涤3次，滴加0.2～0.5 ml DAB显色液，室温孵育5～30 min或根据显色情况孵育适当时间。
（8）用PBS洗涤3次，直接进行观察，或用95%乙醇脱水5 min，再用100%乙醇脱水2次，每次约3 min，再用二甲苯透明2次，每次5 min，随后封片观察。
2.注意事项 一定要设立阳性和阴性细胞对照。阳性对照可使用DNA 酶Ⅰ部分降解的标本，阴性对照不加Td T酶，其余步骤与实验组相同。