密度梯度离心法
密度梯度离心法是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。
1.实验原理 在超速离心力作用下，使溶液形成从低到高连续分布的密度阶层。通过密度梯度离心，使样品中的外泌体沉降在某一个密度范围内。
2.主要材料和设备 1×PBS，无菌离心管，OptiPrep TM碘克沙醇溶液，60%（w／v）；超速离心机，-80℃冰箱。
3.操作流程 以提取细胞培养上清液中的外泌体为例。
（1）收集50 ml细胞培养上清液，4℃，500 g离心10 min，吸取上清液。
（2）4℃，5 000 g离心10 min，吸取上清液。
（3）4℃，10 000 g离心1 h，取沉淀即为粗纯化的外泌体，加入1.5 ml 1×PBS重悬。
（4）制备不连续梯度的碘克沙醇溶液。
（5）将配制好的碘克沙醇溶液3 ml 40%（w／v）、3 ml 20%（w／v）、3 ml 10%（w／v）和2.5 ml 5%（w／v）依次加入管中。
（6）将外泌体溶液加至梯度顶部，4℃，100 000 g离心18 h。(https://www.daowen.com)
（7）将离心后的液体由上而下进行分馏，按照1 ml／管，分成13管。
（8）4℃，100 000 g离心1 h，取沉淀。
（9）回收外泌体层，用2 ml 1×PBS重悬，4℃，100 000 g离心2.5 h，取沉淀。
（10）用100μl 1×PBS重悬沉淀，-80℃条件下可保存1年。
4.优缺点 分离效果较好，可获得纯度较高的外泌体。外泌体结构和功能保持较好。但前期工作量大，需要配制梯度介质溶液。得到的外泌体量不多，操作复杂，不易掌握，较费时。
5.注意事项
（1）离心效果仅取决于样品颗粒的浮力密度差，与样品颗粒大小和形状无关。
（2）常用于大小和形状相近而密度差异较大的物质分离。
（3）严格控制离心时间，若时间过长，可能导致所有样品全部到达离心管底部；而时间不足时，样品未能分离开来。