自噬的实验性调控

通过实验性激活或抑制自噬，观察细胞行为或效应分子的变化，包括药物处理、自噬基因敲除、沉默或过表达。常用的抑制自噬及诱导自噬的药物及机制如表16-1所示。

表161 常用的自噬抑制剂和自噬激活剂

(https://www.daowen.com)

在自噬流观察中，采用雷帕霉素刺激和饥饿培养是最为常规的自噬流活化方法，但两者在GFP-LC3的蛋白质免疫印迹检测中却可观察到截然不同的结果。当使用雷帕霉素处理细胞或饥饿诱导自噬活化后，LC3-Ⅱ蛋白均发生降解。雷帕霉素属于温和的自噬活化方式，使用蛋白质免疫印迹检测可观察到游离GFP标签条带，具有一定的时间和浓度依赖性。在进行细胞饥饿培养后，细胞需要大量内源性蛋白质提供生存所需养分，导致溶酶体中p H 急剧下降，GFP蛋白随即被降解，因此无法观察到游离GFP标签条带。但无论使用雷帕霉素还是饥饿处理细胞，使用LC3B抗体均能够观察到内源性LC3B-Ⅱ的表达增加。

通过RNAi干扰Atg3、Atg5、Atg7及Beclin-1等自噬相关基因的表达后，细胞表现为自噬功能缺失。与工具药相比，通过基因沉默或敲除技术来抑制自噬具有相对强的特异性。一些蛋白质在很低的表达量时仍然可以介导自噬发生，因此，成功基因沉默后的细胞不但不表达被抑制的蛋白质，而且在自噬诱导剂处理后也不发生自噬。还有学者通过构建显性负突变体，使一些自噬相关蛋白质失去功能，从而也可抑制自噬的发生。