对固定于膜上的蛋白质进行染色或者参照蛋白质分子量标准进行定位

对固定于膜上的蛋白质进行染色的方法有多种，但仅有丽春红S染色法可与所有免疫学检测方法兼容，该染料只会短暂显色，在进行蛋白质免疫印迹时可被洗去。因此，丽春红S染色并不影响随后用于检测抗原的显色反应（这些显色反应是由已偶联抗体的碱性磷酸酶或过氧化物酶等催化）。然而，由于其显示的紫红色不容易拍摄下来，这种染色不能提供永久性实验记录，只能提供蛋白质转移情况的直观证据并对蛋白质分子量标准参照物进行定位，标准蛋白质在膜上的位置可用铅笔或不褪色的墨水标记下来。

在蛋白质免疫印迹实验中经常用到蛋白质分子量标准（又称蛋白Marker，protein ladder）。它是纯化好的不同分子量的蛋白质混合物，通过与染料共价偶联，在电泳过程中或转膜时可直接观察：①在电泳时监测电泳情况和估计迁移率；②转膜后蛋白质转膜是否完全。因此一般电泳时加入预染型Marker，转膜后则不必对膜进行染色判断。如图9-8所示的即用型预染蛋白Marker。

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图9-8　预染蛋白Marker示意图

（分子量范围：10～250 kD，条带数量：9 条带，分子量：～250、130、100、70、55、35、25、15、10 k D；颜色：蓝色、橙色、绿色）