PCR技术的基本原理

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是体外扩增DNA 序列的技术，具有特异、灵敏度高、产率高、离体、快速、简便、重复性好、易自动化、对标本纯度要求低等优点。PCR技术与分子克隆和DNA序列分析方法几乎构成了分子生物学实验的工作基础。

类似于体内DNA的半保留复制，PCR是遵循碱基互补配对，依赖于引物起始，沿模板链定向延伸的体外DNA合成技术。其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸3个基本反应步骤构成。①高温变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使其双链解离成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备。②低温退火：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。③中温延伸：DNA模板-引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以d NTP为反应原料，靶序列为模板，合成一条新的与模板DNA互补的链。

重复循环变性-退火-延伸3个过程，就可获得更多的“半保留复制链”。这些新链又可成为下次循环的模板，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y=（1+X）n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值（图8-1）。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期，最终到达平台期。平台期取决于PCR扩增效率、DNA 聚合酶的种类和活性及非特异性产物的竞争等因素。

图8-1　PCR产物的增长——理论增长和实际增长